目的建立去泛素化酶OTUD6A基因敲除小鼠模型,并對(duì)該模型進(jìn)行初步表型分析。方法基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建OTUD6A基因敲除小鼠;利用PCR、qPCR和Western blot技術(shù)(WB)分別在DNA水平、mRNA水平和蛋白水平上檢測(cè)OTUD6A基因的表達(dá);統(tǒng)計(jì)雄性O(shè)TUD6A純合敲除(OTUD6A~(-/-))小鼠和雌性O(shè)TUD6A雜合子(OTUD6A~(+/-))小鼠交配所得后代各基因型小鼠比例及生長(zhǎng)發(fā)育情況,對(duì)小鼠各組織器官利用蘇木素-伊紅染色(HE染色)進(jìn)行病理學(xué)分析。結(jié)果成功建立OTUD6A基因敲除小鼠模型,該基因敲除小鼠可正常生長(zhǎng)繁殖并符合伴性遺傳定律。與同窩野生型(WT)小鼠相比,純合敲除(OTUD6A~(-/-))小鼠在體型和體質(zhì)量上無(wú)顯著差異,主要組織臟器也無(wú)明顯的病理學(xué)異常。結(jié)論成功構(gòu)建OTUD6A基因敲除小鼠模型。純合敲除(OTUD6A~(-/-))小鼠可正常生長(zhǎng)發(fā)育,與WT小鼠相比無(wú)顯著差異。
【部分圖文】：

針對(duì)OTUD6A基因，經(jīng)過(guò)在體外的sgRNA設(shè)計(jì)和構(gòu)建、sgRNA的活性測(cè)試、Donor載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建，以及在體內(nèi)的受精卵顯微注射，獲得陽(yáng)性F0代小鼠。F0代雜合子小鼠和野生型背景鼠交配得到F1代小鼠（本部分由南京生物醫(yī)藥研究院完成）。經(jīng)由圖1A的繁配策略，可得到后代小鼠。PCR鑒定結(jié)果顯示，WT小鼠僅能鑒定到切除前擴(kuò)增出的單條基因片段，大小為246 bp;KO小鼠僅能鑒定到切除后擴(kuò)增出的單條基因片段，大小為721 bp；雜合子（heterozygous,HET）小鼠則能同時(shí)鑒定到2條基因片段（圖1B）。由此可見(jiàn)，基因組水平結(jié)果顯示OTUD6A基因敲除小鼠已構(gòu)建成功。2.2 OTUD6A基因敲除小鼠可正常出生和存活

圖2 WB結(jié)果顯示，OTUD6A在睪丸組織中特異性高表達(dá)，且OTUD6A KO小鼠各組織臟器中的OTUD6A蛋白被顯著敲除，從而可從蛋白表達(dá)水平上證實(shí)OTUD6A基因敲除小鼠構(gòu)建成功。與此同時(shí)，分別提取OTUD6A KO小鼠與WT小鼠睪丸組織的總RNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)，從mRNA水平對(duì)OTUD6A基因敲除小鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示兩者OTUD6A的mRNA水平有顯著差異（P<0.0001，圖3）。圖3 qPCR檢測(cè)WT小鼠與KO小鼠睪丸組織中OTUD6A mRNA的表達(dá)水平

qPCR檢測(cè)WT小鼠與KO小鼠睪丸組織中OTUD6A mRNA的表達(dá)水平
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