本文關(guān)鍵詞：胎牛視網(wǎng)膜干細胞分離培養(yǎng)、生物學鑒定及松蘿酸對其生長影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：視網(wǎng)膜色素變性，年齡相關(guān)性黃斑變性，青光眼視神經(jīng)萎縮，視網(wǎng)膜鈍挫傷等眼科疾病在逐漸威脅著人類的健康，現(xiàn)代科學可通過體外分離培養(yǎng)視網(wǎng)膜干細胞，誘導分化成視網(wǎng)膜損傷成分，然后進行體內(nèi)移植，替換其損傷成分，從而重建視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的研究。松蘿酸作為我國的新型靶細胞治療藥物，其對干細胞治療前景有待考究。利用松蘿酸藥物處理視網(wǎng)膜干細胞很有希望成為治療眼疾的一條輔助的途徑，為我們最終有效的治療這些眼病，恢復患者的視功能提供了新的思路。 本研究采用機械吹打法從胎牛眼球睫狀緣部分分離視網(wǎng)膜干細胞（Retinal stemcells, RSCs），并對其生物學特性進行研究，通過免疫熒光和RT-PCR方法鑒定RSCs標志物Nestin、Chx-10和Pax-6，并使用在培養(yǎng)基中添加胎牛血清法定向誘導其向星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞及少突膠質(zhì)細胞誘導分化，檢測其多向分化潛能。并以分離培養(yǎng)的視網(wǎng)膜干細胞為研究對象，采用懸浮培養(yǎng)法進行細胞培養(yǎng)，研究了不同濃度的松蘿酸藥物處理RSCs進而觀察對其生長影響及其相關(guān)生物學機制。經(jīng)倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)；透射電鏡觀察細胞結(jié)構(gòu)變化；RT-PCR檢測不同濃度的松蘿酸作用RSCs前后bax、bcl-2、Fas和caspase基因mRNA表達水平的變化。 結(jié)果表明： 1.采用機械分離法獲得的視網(wǎng)膜干細胞，無血清懸浮培養(yǎng)傳至第10代，獲得了大量純度較高的視網(wǎng)膜干細胞。 2.闡明了視網(wǎng)膜干細胞體外生長規(guī)律，，并繪制了生長曲線，細胞生長曲線呈“S”型。 3.對視網(wǎng)膜干細胞進行了核型檢測，結(jié)果顯示其二倍體染色體數(shù)目為2n=60，包括1對性染色體和29對常染色體，性染色體為X、Y，雄性為同配XY，雌性為異配XX。 4.對獲得的細胞進行了鑒定，免疫熒光鑒定結(jié)果為視網(wǎng)膜干細胞能夠表達Nestin神經(jīng)干細胞特異性基因，以及視網(wǎng)膜細胞特異性標志物Pax-6及Chx-10。RT-PCR結(jié)果為Sox2，nestin,Six6,Pax6均呈陽性表達。 5.對細胞進行了體外誘導分化的研究，采用血清誘導法成功將視網(wǎng)膜干細胞誘導為星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞及少突膠質(zhì)細胞，且特異性基因均呈陽性表達。 6.不同濃度的松蘿酸對視網(wǎng)膜干細胞進行藥物作用，形態(tài)學觀察結(jié)果顯示，細胞懸浮生長，呈圓形，折光性好，細胞胞體小而核較大，細胞表面光滑，無明顯凸起。 7.經(jīng)松蘿酸處理后的視網(wǎng)膜干細胞經(jīng)透射電鏡觀察。細胞胞質(zhì)豐滿均一，核大胞漿少，核仁清晰，核膜完整，胞內(nèi)各細胞器也無明顯變化。 8.經(jīng)RT-PCR檢測松蘿酸凋亡處理后的視網(wǎng)膜干細胞，其凋亡基因bcl-2、bax、Fas和caspase結(jié)果均呈陰性表達，說明松蘿酸對視網(wǎng)膜干細胞作用前后均無明顯變化。
【關(guān)鍵詞】：地衣 松蘿酸 胎牛 視網(wǎng)膜 干細胞 體外培養(yǎng)
【學位授予單位】：齊齊哈爾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 1 前言12-18
• 1.1 研究背景12-13
• 1.2 松蘿植物簡介13-14
• 1.2.1 松蘿酸的抗菌作用13
• 1.2.2 松蘿酸的抗氧化作用13-14
• 1.2.3 松蘿酸的抗輻射作用14
• 1.2.4 松蘿酸的其他作用14
• 1.3 神經(jīng)干細胞的概述14-15
• 1.4 視網(wǎng)膜干細胞概述15
• 1.5 p53 基因15-16
• 1.6 bcl 2 基因家族16
• 1.7 Fas 基因家族16
• 1.8 本研究的目的、意義和選題依據(jù)16-18
• 2 材料與方法18-30
• 2.1 試驗材料與儀器18-19
• 2.1.1 試驗材料18
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備18
• 2.1.3 主要試劑18-19
• 2.1.4 主要試劑的配制19
• （一）細胞培養(yǎng)試劑配制19-21
• （二）生長曲線試劑配制20
• （三）免疫組化檢測試劑配制20-21
• （四）細胞系核型分析試劑配制21
• 2.2 方法21-30
• 2.2.1 視網(wǎng)膜干細胞的分離培養(yǎng)21
• 2.2.2 視網(wǎng)膜干細胞的傳代與凍存21-22
• 2.2.3 視網(wǎng)膜干細胞生長曲線繪制22
• 2.2.4. 核型分析22
• 2.2.5 視網(wǎng)膜干細胞的鑒定22-25
• （一）免疫熒光檢測表面標記22-23
• （二） RT PCR 檢測表面標記23-25
• 1.細胞 total RNA 提取23
• 2.甲醛變性電泳判斷 RNA 完整性23-24
• 3.cDNA 的合成24
• 4.PCR 反應(yīng)24-25
• 2.2.6 視網(wǎng)膜干細胞的誘導分化及鑒定25-27
• （一）視網(wǎng)膜干細胞向星形膠質(zhì)細胞誘導分化25-26
• （二）視網(wǎng)膜干細胞向神經(jīng)元誘導分化26
• （三）視網(wǎng)膜干細胞向少突膠質(zhì)細胞誘導分化26-27
• 2.2.7 藥物處理27
• 2.2.8 藥物處理后形態(tài)學觀察27
• 2.2.9 透射電鏡觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化27-28
• 2.2.10 RT PCR 檢測細胞凋亡相關(guān)基因的變化28-30
• 3 結(jié)果30-42
• 3.1 視網(wǎng)膜干細胞形態(tài)學觀察及凍存復蘇結(jié)果30-31
• 3.2 視網(wǎng)膜干細胞生長曲線的繪制31-32
• 3.3 視網(wǎng)膜干細胞核型分析32-33
• 3.4 視網(wǎng)膜干細胞的鑒定33-36
• 3.4.1 免疫熒光檢測表面標記33-35
• 3.4.2 RT PCR 檢測表面標記35-36
• 3.5 視網(wǎng)膜干細胞的誘導分化及鑒定36-38
• 3.6 藥物處理后形態(tài)學觀察38-39
• 3.7 透射電鏡觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化39-40
• 3.8 RT PCR 檢測細胞凋亡相關(guān)基因的變化40-42
• 4 討論42-45
• 4.1 視網(wǎng)膜干細胞的分離與培養(yǎng)及生長曲線測定42
• 4.2 視網(wǎng)膜干細胞的核型檢測42-43
• 4.3 視網(wǎng)膜干細胞的鑒定43
• 4.4 視網(wǎng)膜干細胞的定向誘導分化及鑒定43
• 4.5 松蘿酸處理后形態(tài)學觀察43-44
• 4.6 透射電鏡觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化44
• 4.7 RT PCR 檢測凋亡基因的表達44-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻46-51
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表學術(shù)論文情況51-52
• 致謝52-53

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：288848