成骨蛋白-1(Osteogenic Protein-1，OP-1)又稱骨形成蛋白-7(Bone Morphogenetic Protein，BMP-7)。最早由Ozkaynak發(fā)現(xiàn)，并于1990年將其基因克隆成功。隨后對它的蛋白組成、生物學(xué)作用等有了深入的認識。OP-1屬TGF-β超家族，與TGF-β家族成員有很高的同源性。人的OP-1基因位于第20號染色體上，其全長cDNA 1878bp，開放讀框1296bp，編碼431個氨基酸，由N端的信號肽、中間的前肽和C端的成熟肽構(gòu)成。成熟而具有活性的OP-1，以二聚體糖蛋白形式存在。OP-1除具有BMP家族成員所特有的骨誘導(dǎo)功能外，還與牙齒發(fā)育，牙體、牙周組織的修復(fù)和礦化，造血系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)等許多重要的生理功能有關(guān)。然而，由于天然來源的OP-1數(shù)量有限，對其功能研究及應(yīng)用都受到了極大的限制，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，使大規(guī)模生產(chǎn)具有活性的OP-1重組蛋白質(zhì)成為可能。 為了拓寬OP-1的研究與應(yīng)用，通過基因工程技術(shù)，獲得具有生物學(xué)活性的OP-1蛋白質(zhì)，探討其在牙齒發(fā)育、礦化中的作用機制，以及作為一種新的牙髓、牙周病治療材料用于臨床，促進修復(fù)性牙本質(zhì)的形成和牙周組織再生等。本課題主要進行了以下幾方面的研究： 一．OP-1成熟肽基因的克隆及多克隆抗體制備 本實驗首先利用RT-PCR技術(shù)，從培養(yǎng)的人牙乳頭細胞中，克隆出人OP-1成熟肽段基因，并在pEH4原核表達載體中獲得高表達，表達量占菌體總蛋白的33％左右。將表達蛋白初步純化，免疫新西蘭大白兔，獲得了兔抗人OP-1多克隆抗血清，效價為1∶100000，為真核系統(tǒng)表達產(chǎn)物的免疫學(xué)檢測及其OP-1的表達和功能研究創(chuàng)造了條件。 二．OP-1全長基因克隆及CHO細胞轉(zhuǎn)染 在OP-1原核表達并制備多克隆抗血清的基礎(chǔ)上，進行OP-1真核系統(tǒng)表達研究。通過獲得的人牙乳頭細胞總RNA，首次采用擴增高GC含量基因的PCR試劑盒，得到hOP-1約1300bp的全長段基因。序列測定正確后，插入pCI高效真核表達載體，并利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染CHO細胞，
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2000
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

隨機挑取轉(zhuǎn)化生長的菌落，按質(zhì)粒提取EeoRI和Sall進行雙酶切，即在10林l酶(0.5協(xié)g一1.0件g)，相應(yīng)的loxbueffrl協(xié)l，加重制性內(nèi)切酶各0.5川，37”C溫育lh，進行瓊脂同時將所提質(zhì)粒按1:100稀釋后做為PC原PCR條件，再進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠2.8核昔酸序列分析將酶切和PCR擴增鑒定的陽性克隆提取質(zhì)3.結(jié)果3.1總RNA提取將所提取的人牙乳頭細胞總RNA進行瓊8sl和5s三條帶，分光光度計測定A26了A280=.0所獲得的總RNA無明顯的降解并且有較高的196林留ml。(圖l)

PCR產(chǎn)物及重組質(zhì)粒的酶切Lane1PCRMarkerLaneZ重組質(zhì)粒酶切鑒定Lane3PCRrfagment組質(zhì)粒進行核昔酸序列測定，一致(圖4)。1)，具有很強的骨誘導(dǎo)作用，能進修復(fù)性牙本質(zhì)，牙骨質(zhì)的形、骨骼及胎盤等組織[’]，對胚胎觀的臨床應(yīng)用前景[5]。已有文一1的表達，但有關(guān)在人牙胚發(fā)育

6hOP一1P/EH4表達載體的酶Lanel重組質(zhì)粒酶切鑒定LnaeZ重組質(zhì)粒L即e3DNAM肚ker大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達重組陽性克隆，通過溫度誘導(dǎo)目陽性克隆，經(jīng)溫度誘導(dǎo)后，SDS一蛋白(圖7)。表達蛋白經(jīng)薄層%(圖8)。定血清抗體效價。按:1100;1:2P一1多克隆抗體，酶聯(lián)免疫檢測儀D值的最小濃度為102400:1。
【相似文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 岳玲;hOP-1基因的克隆、多抗制備及其在真核細胞中的表達[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2000年

本文編號：2884895