對(duì)乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列(HPRE)在非細(xì)胞毒機(jī)制中的作用及其異質(zhì)性的生物學(xué)意義進(jìn)行研究，探討IFN-γ、TNF-α和IFN-α對(duì)乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的影響。 體外構(gòu)建含有HPRE片段的pDM138質(zhì)粒(含有CAT報(bào)告基因)，應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染HepG_2細(xì)胞，觀察細(xì)胞因子對(duì)重組質(zhì)粒載體CAT報(bào)告基因活性表達(dá)的影響，CAT基因活性檢測(cè)采用ELISA試劑盒。結(jié)果成功構(gòu)建了含有HPRE片段的重組質(zhì)粒載體。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞CAT活性表達(dá)明顯增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染空載體的HepG2細(xì)胞僅有本底表達(dá)。IFN-γ和TNF-α對(duì)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞CAT活性表達(dá)的影響均具有濃度依賴性，而對(duì)空載體CAT活性的表達(dá)無影響。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞在未加入細(xì)胞因子時(shí)，其CAT表達(dá)活性為896.5±213.6 pg/ml：加入IFN-γ、TNF-α及IFN-γ+TNF-α作用48h后，其CAT表達(dá)活性分別為324.4±56.8，395.8±82.3，175.3±35.6pg/ml，與未加入時(shí)比較，t=5.19，4.39，6.68，P＜0.01，差異有顯著性。提示IFN-γ和TNF-α可能通過抑制HPRE的功能，調(diào)控乙型肝炎病毒基因的表達(dá)。 采用PCR反應(yīng)產(chǎn)物直接測(cè)序法，對(duì)31例中國南方HBV感染者血清HBVDNA的HPRE片段擴(kuò)增后測(cè)序，與Genbank中來源于歐美白種人群HBV感染者HBVDNA序列進(jìn)行比較，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果顯示前者HPRE的β_2區(qū)，存在3個(gè)位點(diǎn)變化，分別為1504nt(T→C)，占75.0％；1508nt(C→T)，占57.1％；C→G，占10.7％；1509nt(C→T)，占60.7％；在后者HPRE序列中均未發(fā)現(xiàn)上述位點(diǎn)變化。HPRE位點(diǎn)差異與HBVDNA水平未見明顯相關(guān)。提示黃種人與白種人群HBV感染者的HPRE序列存在差異位點(diǎn)。 應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)，體外構(gòu)建含有HPRE位點(diǎn)變異的重組質(zhì)粒載體，觀察HPRE位點(diǎn)變異對(duì)HPRE功能以及細(xì)胞因子抗HBV機(jī)制的影響。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，成功構(gòu)建了含有HPRE變異位點(diǎn)的重組質(zhì)粒載體。與野生株比較，1504nt突變株的CAT活性明顯升高，差異有顯著性；1508nt突變株則無明顯變化。在IFN-γ或/和TNF-α作用下，三種突變株的CAT活性均明顯下 降，在正N一a作用下，1504nt突變株和巧以+1 508nt突變株的CAI，表達(dá)活 性明顯降低，差異有顯著性(P0.01);而1508nt突變株的C戶a，表達(dá)活性無 明顯變化(P0.05)。提示HPRE15O4nt位點(diǎn)變異可能影響HPRE功能，而 1508nt位點(diǎn)變異可能逃逸了正N一Q對(duì)HPRE的抑制作用。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

2.1HPRE·pDM138重組載體的鑒定HPRE一pDM138重組載體的測(cè)序由大連寶生生物工程公司完成。測(cè)序結(jié)果用DNASIS軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列比較分析，確定克隆成功，酶切鑒定結(jié)果見圖2。234M000bP000bP500bP00bP366b250bP500bP000bPM:DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志;1，HPRE片段;2，酶切質(zhì)粒;3，重組質(zhì)粒;4，pDM138質(zhì)粒圖2重組質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定2.2轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)經(jīng)液相閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)，空載體與野生株的轉(zhuǎn)染效
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 成軍;乙型肝炎病毒基因異質(zhì)性及準(zhǔn)種特點(diǎn)研究的臨床意義[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2002年02期

2 中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與,寄生蟲病學(xué)分會(huì),肝病學(xué)分會(huì);病毒性肝炎防治方案[J];中華肝臟病雜志;2000年06期

3 鄧慶麗,黃志明,邵靜;HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白克隆篩選和分析[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2000年06期

本文編號(hào)：2884194