目的： 1．建立從大鼠骨髓前體細胞分離、培養(yǎng)和擴增樹突狀細胞(dendritic cell, DC)的方法；研究影響骨髓DC(bone marrow derived DC, BM-DC)分化、成熟的相關因素以及不同分化時期DC的免疫免疫生物特性。 2．構建人TGFβ1基因的真核表達質粒TGFβ1-pcDNA3以及反義TGFβ1-pcDNA3(ASTGFβ1-pcDNA3)并轉染大鼠DC，研究TGFβ1基因轉染對DC的成熟分化以及免疫功能的影響。 3．觀察TGFβ1-DC在受者大鼠體內遷移歸巢途徑及微嵌合水平，檢測受者次級淋巴器官T細胞凋亡和端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表達的變化。 4．探討TGFβ1-DC對移植心臟的急性排斥反應發(fā)生時間、排斥反應級別以及存活時間的影響；并進一步研究TGFβ1-DC輸注對移植受者體內多種相關趨化因子及其受體表達的影響。 方法： 分離F344大鼠骨髓前體細胞，在rmGM-CSF+TGFβ1或rmGM-CSF+rmIL-4的聯(lián)合作用下，培養(yǎng)、擴增大鼠骨髓來源DC(bone marrow derived DC, BM-DC)。分別從形態(tài)學(光鏡、電鏡)、免疫細胞化學(FACS，ICC)以及免疫生物學(MLR)等方面研究大鼠BM-DC的免疫生物特性。構建重組人TGFβ1-pcDNA3表達質粒，并轉染DC制備TGFβ1-DC，應用多種分子生物學技術(RT-PCR, Western blot等)及免疫學技術研究TGFβ1基因轉染對于DC發(fā)育分化、分子表型以及免疫功能的影響，檢測TGFβ1-DC刺激T細胞增殖的能力；TGFβ1-DC異體輸注Lewis大鼠后，以免疫組織化學檢測TGFβ1-DC的遷移路線和分布特征，TUNEL檢測受者脾T細胞凋亡以及端粒酶逆轉錄酶hTERT的表達。按Ono's方法建立大鼠同種異體心臟移植模型，觀察TGFβ1-DC輸注對于移植心臟排斥反應出現(xiàn)時間、反應級別以及存活時間的影響，以免疫組織化學方法觀察移植后相關趨化因子的表達和變化。 結果： 中文摘要 1、應用細胞因子rmGM一CSF+rrIL一4，骨髓前體細胞在培養(yǎng)第6天時，可觀 察到有大小不等的集落生成，吞飲和吞噬能力較強，MLR實驗中不能刺 激T細胞增殖。培養(yǎng)至第ro天，集落減小并減少，多數細胞從集落中 釋放，散在懸浮細胞增多。細胞多具有較長的樹枝狀突起，細胞吞飲吞 噬能力減低，MHCll類分子和B7一2分子表達增高，刺激T細胞能力增 強。應用n莊L一4可提高細胞得率，每只大鼠二后肢骨髓前體細胞經過擴 增可得到8一20xl護個細胞。 2、一定濃度的thTGF印對Dc的擴增和分化具有抑制作用，細胞集落較少， 細胞成熟緩慢，大多數細胞無突起或突起較短。MHCll類分子和B7一2 分子表達較低，刺激T細胞增殖能力低下，但加入LPS刺激后MLR刺 激指數與IL一4對照組細胞無明顯差異，細胞得率略低。 3、通過酶切后連接、質粒轉化、擴增與抽提，構建得到TGFpl重組真核表 達質粒TGF印一peDNA3。經酶切電泳和DNA測序鑒定，證實重組質粒 構建正確。 4、以Westem blot、RT-PCR、免疫細胞化學以及免疫熒光染色顯示脂質體 DOTAp可介導TGF困一peDNA3轉染大鼠imDc，并得到有效mRNA和 蛋白表達，經測定轉染效率可達到18~23%。 5、應用FAcs和免疫細胞化學等方法檢測發(fā)現(xiàn)，轉染TGF印基因得到的 ToFpl一ne表面盯IB、B7一2、IcAM一l和ox62等分子表達均明顯低于 對照組，MLR顯示，TGF印一DC刺激T細胞增殖能力低下。TGF印基 因轉染對DC生長無明顯抑制作用。 6、轉染后各組DC輸注Lewis大鼠發(fā)現(xiàn)，各組DC主要歸巢到受者大鼠的 次級淋巴器官胸腺依賴區(qū)，其中尤其以TGF印一DC組在輸注后第7一14 天時在脾的動脈周圍淋巴鞘和邊緣區(qū)數量最多。 7、經TUN舊L、hTERT等方法顯示，TGFpl一DC組受者大鼠脾動脈周圍淋 巴鞘等處的T細胞凋亡水平明顯高于對照組，并且發(fā)現(xiàn)該組的T細胞 h花RT表達水平明顯低于對照組。 8、各組DC異體輸注一周后行F344葉Lewis大鼠的心臟移植，發(fā)現(xiàn) TGF印一DC組排斥反應發(fā)生時間延遲，排斥反應級別明顯降低，移植心 中文摘要 臟存活時間顯著延長，最長可達51天，平均存活時間達到33.14士7.88 天，與其它組相比具有顯著差異(p0 .01) 9、研究各組移植心臟、受者脾和淋巴結等器官趨化因子RANTES、MCP一1、 Mlp一la、FKN及其受體的表達，發(fā)現(xiàn)TGF印一DC輸注不同程度地降低 了以上趨化因子的表達，改變其表達模式，提示TGF印下調相關趨化因 子表達可能是TGF印一DC增強移植心臟耐受性的機制之一。 結論: 1、TGF印可降低培養(yǎng)BM一Dc的MHcll類分子和B7一2分子表達以及刺激 T細胞能力，該效應可被LPS所逆轉。 2、脂質體介導TGF印基因轉染Dc可以獲得有效表達，TGF印一Dc的分 子表型、分化程度均顯示TGF印一DC為imDC。 3、TGF印一Dc術前輸注受者大鼠可延遲移植心臟排斥反應發(fā)生時間，降低 排斥反應級別，延長移植心臟存活時間。 4、TGF印一DC輸注可改變移植心臟及受者次級淋巴器官相關趨化因子及 其受體的表達程度和表達模式。 創(chuàng)新點及意義: 1、結合以往小鼠DC培養(yǎng)經驗，經過改良，建?
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

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不一的細胞集落(loox)圖l一IB.培養(yǎng)sd，篩選后的DC集落(loox)圖1一IC.培養(yǎng)6d，擴增的DC集落(2oox圖l一ID.培養(yǎng)gd，DC由集落釋放，懸浮生長于培液中(2oox)含A圖l一ZA培養(yǎng)6dA組DC，Giemsa染色示細胞突起少，胞質中有較多囊泡(400x)圖l一ZB.培養(yǎng)10dA組DC，Giemsa染色示細胞突起多而長，囊泡減少(4oox)‘戶備‘.每C圖l一ZC.培養(yǎng)10dB組DC

呈帆狀(3(X)ox)圖1一3C.掃描電鏡示培養(yǎng)12dA組DC突起豐富，呈樹枝狀(4(XX)x)圖1一4A.培養(yǎng)10dA組DC透射電鏡像，顯示胞質內少量囊泡和大量糖原，突起多而長(40(刃x)吟‘J.I口J一一一月B圖1一4B.培養(yǎng)10dB組DC透射電鏡像，胞質內較多囊泡，突起較少(4《XX)x)圖l一SA.DII熒光染色示培養(yǎng)10d的A組DC(4(X)x)，令二‘.件J今1..、、稱刁，，、-.獷，戶‘，份
【參考文獻】

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本文編號：2883925