目的： 1．建立從大鼠骨髓前體細(xì)胞分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)的方法；研究影響骨髓DC(bone marrow derived DC, BM-DC)分化、成熟的相關(guān)因素以及不同分化時(shí)期DC的免疫免疫生物特性。 2．構(gòu)建人TGFβ1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒TGFβ1-pcDNA3以及反義TGFβ1-pcDNA3(ASTGFβ1-pcDNA3)并轉(zhuǎn)染大鼠DC，研究TGFβ1基因轉(zhuǎn)染對(duì)DC的成熟分化以及免疫功能的影響。 3．觀察TGFβ1-DC在受者大鼠體內(nèi)遷移歸巢途徑及微嵌合水平，檢測(cè)受者次級(jí)淋巴器官T細(xì)胞凋亡和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表達(dá)的變化。 4．探討TGFβ1-DC對(duì)移植心臟的急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間、排斥反應(yīng)級(jí)別以及存活時(shí)間的影響；并進(jìn)一步研究TGFβ1-DC輸注對(duì)移植受者體內(nèi)多種相關(guān)趨化因子及其受體表達(dá)的影響。 方法： 分離F344大鼠骨髓前體細(xì)胞，在rmGM-CSF+TGFβ1或rmGM-CSF+rmIL-4的聯(lián)合作用下，培養(yǎng)、擴(kuò)增大鼠骨髓來(lái)源DC(bone marrow derived DC, BM-DC)。分別從形態(tài)學(xué)(光鏡、電鏡)、免疫細(xì)胞化學(xué)(FACS，ICC)以及免疫生物學(xué)(MLR)等方面研究大鼠BM-DC的免疫生物特性。構(gòu)建重組人TGFβ1-pcDNA3表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染DC制備TGFβ1-DC，應(yīng)用多種分子生物學(xué)技術(shù)(RT-PCR, Western blot等)及免疫學(xué)技術(shù)研究TGFβ1基因轉(zhuǎn)染對(duì)于DC發(fā)育分化、分子表型以及免疫功能的影響，檢測(cè)TGFβ1-DC刺激T細(xì)胞增殖的能力；TGFβ1-DC異體輸注Lewis大鼠后，以免疫組織化學(xué)檢測(cè)TGFβ1-DC的遷移路線(xiàn)和分布特征，TUNEL檢測(cè)受者脾T細(xì)胞凋亡以及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT的表達(dá)。按Ono's方法建立大鼠同種異體心臟移植模型，觀察TGFβ1-DC輸注對(duì)于移植心臟排斥反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間、反應(yīng)級(jí)別以及存活時(shí)間的影響，以免疫組織化學(xué)方法觀察移植后相關(guān)趨化因子的表達(dá)和變化。 結(jié)果： 中文摘要 1、應(yīng)用細(xì)胞因子rmGM一CSF+rrIL一4，骨髓前體細(xì)胞在培養(yǎng)第6天時(shí)，可觀 察到有大小不等的集落生成，吞飲和吞噬能力較強(qiáng)，MLR實(shí)驗(yàn)中不能刺 激T細(xì)胞增殖。培養(yǎng)至第ro天，集落減小并減少，多數(shù)細(xì)胞從集落中 釋放，散在懸浮細(xì)胞增多。細(xì)胞多具有較長(zhǎng)的樹(shù)枝狀突起，細(xì)胞吞飲吞 噬能力減低，MHCll類(lèi)分子和B7一2分子表達(dá)增高，刺激T細(xì)胞能力增 強(qiáng)。應(yīng)用n莊L一4可提高細(xì)胞得率，每只大鼠二后肢骨髓前體細(xì)胞經(jīng)過(guò)擴(kuò) 增可得到8一20xl護(hù)個(gè)細(xì)胞。 2、一定濃度的thTGF印對(duì)Dc的擴(kuò)增和分化具有抑制作用，細(xì)胞集落較少， 細(xì)胞成熟緩慢，大多數(shù)細(xì)胞無(wú)突起或突起較短。MHCll類(lèi)分子和B7一2 分子表達(dá)較低，刺激T細(xì)胞增殖能力低下，但加入LPS刺激后MLR刺 激指數(shù)與IL一4對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯差異，細(xì)胞得率略低。 3、通過(guò)酶切后連接、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增與抽提，構(gòu)建得到TGFpl重組真核表 達(dá)質(zhì)粒TGF印一peDNA3。經(jīng)酶切電泳和DNA測(cè)序鑒定，證實(shí)重組質(zhì)粒 構(gòu)建正確。 4、以Westem blot、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)以及免疫熒光染色顯示脂質(zhì)體 DOTAp可介導(dǎo)TGF困一peDNA3轉(zhuǎn)染大鼠imDc，并得到有效mRNA和 蛋白表達(dá)，經(jīng)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到18~23%。 5、應(yīng)用FAcs和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染TGF印基因得到的 ToFpl一ne表面盯IB、B7一2、IcAM一l和ox62等分子表達(dá)均明顯低于 對(duì)照組，MLR顯示，TGF印一DC刺激T細(xì)胞增殖能力低下。TGF印基 因轉(zhuǎn)染對(duì)DC生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。 6、轉(zhuǎn)染后各組DC輸注Lewis大鼠發(fā)現(xiàn)，各組DC主要?dú)w巢到受者大鼠的 次級(jí)淋巴器官胸腺依賴(lài)區(qū)，其中尤其以TGF印一DC組在輸注后第7一14 天時(shí)在脾的動(dòng)脈周?chē)馨颓屎瓦吘墔^(qū)數(shù)量最多。 7、經(jīng)TUN舊L、hTERT等方法顯示，TGFpl一DC組受者大鼠脾動(dòng)脈周?chē)?巴鞘等處的T細(xì)胞凋亡水平明顯高于對(duì)照組，并且發(fā)現(xiàn)該組的T細(xì)胞 h花RT表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。 8、各組DC異體輸注一周后行F344葉Lewis大鼠的心臟移植，發(fā)現(xiàn) TGF印一DC組排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間延遲，排斥反應(yīng)級(jí)別明顯降低，移植心 中文摘要 臟存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)，最長(zhǎng)可達(dá)51天，平均存活時(shí)間達(dá)到33.14士7.88 天，與其它組相比具有顯著差異(p0 .01) 9、研究各組移植心臟、受者脾和淋巴結(jié)等器官趨化因子RANTES、MCP一1、 Mlp一la、FKN及其受體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TGF印一DC輸注不同程度地降低 了以上趨化因子的表達(dá)，改變其表達(dá)模式，提示TGF印下調(diào)相關(guān)趨化因 子表達(dá)可能是TGF印一DC增強(qiáng)移植心臟耐受性的機(jī)制之一。 結(jié)論: 1、TGF印可降低培養(yǎng)BM一Dc的MHcll類(lèi)分子和B7一2分子表達(dá)以及刺激 T細(xì)胞能力，該效應(yīng)可被LPS所逆轉(zhuǎn)。 2、脂質(zhì)體介導(dǎo)TGF印基因轉(zhuǎn)染Dc可以獲得有效表達(dá)，TGF印一Dc的分 子表型、分化程度均顯示TGF印一DC為imDC。 3、TGF印一Dc術(shù)前輸注受者大鼠可延遲移植心臟排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間，降低 排斥反應(yīng)級(jí)別，延長(zhǎng)移植心臟存活時(shí)間。 4、TGF印一DC輸注可改變移植心臟及受者次級(jí)淋巴器官相關(guān)趨化因子及 其受體的表達(dá)程度和表達(dá)模式。 創(chuàng)新點(diǎn)及意義: 1、結(jié)合以往小鼠DC培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)改良，建?
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類(lèi)】：R392
【部分圖文】：

一IC.培養(yǎng)6d，擴(kuò)增的DC集落(2oox圖l一ID.培養(yǎng)gd，DC由集落釋放，懸浮生長(zhǎng)于培液中(2oox)

不一的細(xì)胞集落(loox)圖l一IB.培養(yǎng)sd，篩選后的DC集落(loox)圖1一IC.培養(yǎng)6d，擴(kuò)增的DC集落(2oox圖l一ID.培養(yǎng)gd，DC由集落釋放，懸浮生長(zhǎng)于培液中(2oox)含A圖l一ZA培養(yǎng)6dA組DC，Giemsa染色示細(xì)胞突起少，胞質(zhì)中有較多囊泡(400x)圖l一ZB.培養(yǎng)10dA組DC，Giemsa染色示細(xì)胞突起多而長(zhǎng)，囊泡減少(4oox)‘戶(hù)備‘.每C圖l一ZC.培養(yǎng)10dB組DC

呈帆狀(3(X)ox)圖1一3C.掃描電鏡示培養(yǎng)12dA組DC突起豐富，呈樹(shù)枝狀(4(XX)x)圖1一4A.培養(yǎng)10dA組DC透射電鏡像，顯示胞質(zhì)內(nèi)少量囊泡和大量糖原，突起多而長(zhǎng)(40(刃x)吟‘J.I口J一一一月B圖1一4B.培養(yǎng)10dB組DC透射電鏡像，胞質(zhì)內(nèi)較多囊泡，突起較少(4《XX)x)圖l一SA.DII熒光染色示培養(yǎng)10d的A組DC(4(X)x)，令二‘.件J今1..、、稱(chēng)刁，，、-.獷，戶(hù)‘，份
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2883925