實驗?zāi)康?系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是典型多基因遺傳的自身免疫性疾病，發(fā)病率較高，多發(fā)于年輕女性，其重要特征是T和B淋巴細胞對自身核抗原耐受性喪失，產(chǎn)生多種抗核抗原成分抗體，形成免疫復(fù)合物沉積于不同組織并引起炎癥。遺傳、環(huán)境、免疫、激素等多種因素參與自身抗體產(chǎn)生及SLE發(fā)病，其中遺傳因素起重要作用。 隨著單基因病遺傳連鎖分析的巨大成功，以及人類基因組計劃實施以后對基因分析方法的推動，復(fù)雜疾病致病基因的克隆成為當(dāng)代遺傳學(xué)研究的重點。通過特征表型進行疾病易感基因染色體定位，對揭示疾病成因有重要意義。自身抗體是自身免疫病的重要標(biāo)志，抗核抗體為引起狼瘡細胞形成的主要抗體，也是SLE最早被檢測的自身抗體之一，一般在確診SLE兩年前患者血清中已出現(xiàn)抗dsDNA抗體，抗染色質(zhì)抗體則出現(xiàn)更早。SLE患者和狼瘡鼠模型自身免疫反應(yīng)的發(fā)作都以自身抗核抗體的早期出現(xiàn)為特征，因此抗核抗體的產(chǎn)生對SLE發(fā)病起著決定性的作用。狼瘡鼠可自發(fā)出現(xiàn)抗核抗體，在無菌環(huán)境亦然，提示外來因素對自身抗核抗體的影響不大；SLE病人的健康一級親屬也有自身抗核抗體的出現(xiàn)，同卵雙生子血清抗體一致率高達92％，說明先天遺傳因素是其發(fā)生的主要原因。 以人為對象進行遺傳連鎖分析研究，難度較大，重復(fù)性差。狼瘡鼠在遺傳定位研究方面有不可比擬的優(yōu)勢。應(yīng)用微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記結(jié)合數(shù)量性狀位點分析，可以對復(fù)雜疾病進行精確的易感基因染色體定位。本課題以(NZB×NZW)F1×NZB和(NZB×NZW)F1×NZW回交小鼠為研究對象，對來源于NZW和NZB小鼠的系統(tǒng)性紅斑狼瘡自身抗核抗體易感基因進行微衛(wèi)星DNA遺傳標(biāo)記QTL分析，確定小鼠的IgG型抗染色質(zhì)自身抗體、抗DNA自身抗體和抗組蛋白自身抗體的易感基因的染色體精確定位，為人類同源基 因的克隆和鑒定奠定基礎(chǔ)，并為進一步闡明SLE及其它自身免疫病的發(fā)病 機理，以及開發(fā)新的可靠的治療方法提供理論依據(jù)。 實驗方法 1，以酶聯(lián)免疫吸附分析法檢測8月齡新西蘭狠瘡鼠NZB、NZW、NZB/ WFI血清中IgG、I娜型抗DNA抗體和抗染色質(zhì)、組蛋白抗體滴度，比較 NZB、NZW、NZB/W FI各種抗體水平。 2.繁育回交小鼠，篩選NZB和NzW間具有長度多態(tài)性的微衛(wèi)星DNA 遺傳標(biāo)記，染色體兩端遺傳標(biāo)記距兩端距離10 cM(里摩)，遺傳標(biāo)記之間 距離20。M，最終選出覆蓋除性染色體外的全部19條染色體的共約200 個多態(tài)性微衛(wèi)星DNA遺傳標(biāo)記。 3.基因分型:提取鼠尾DNA，用覆蓋小鼠全部基因組的近200個微衛(wèi) 星DNA遺傳標(biāo)記進行PCR一SSLP(PCR一Single Se卿enee玩n納Polymor- phism)分析，根據(jù)分離片段大小確定每只小鼠的每個微衛(wèi)星DNA遺傳標(biāo)記 位點的基因型。 4.回交小鼠血清抗體水平分析:以酶聯(lián)免疫吸附分析法(EUSA)測定8 月齡回交小鼠IgG、IgM型抗染色質(zhì)抗體、抗DNA抗體、抗組蛋白抗體值。 5 .QTL分析:將每只小鼠的每個微衛(wèi)星DNA遺傳標(biāo)記位點的基因型和 抗體值輸人MAPMAKE形QTL和MAPMANAGE甲QTL分析軟件數(shù)據(jù)庫中， 進行基因組掃描，確定狼瘡鼠抗染色質(zhì)抗體、抗DNA抗體、抗組蛋白抗體易 感基因的染色體定位。增加基因組掃描峰值附近的微衛(wèi)星DNA遺傳標(biāo)記 數(shù)量，以獲取更精確的易感基因染色體定位。 6.根據(jù)QTL分析結(jié)果，利用互聯(lián)網(wǎng)查閱基因組數(shù)據(jù)庫，篩選候選基因， 為進一步定性和克隆這些基因打好基礎(chǔ)。 實驗結(jié)果 一、sLE模型新西蘭小鼠I步、壇M型抗核抗體水平分析 1.8月齡NzB小鼠I醛型抗dsDNA抗體及I嬌型抗ssDNA抗體平均 滴度較低。NZW鼠比NZB略高，但無明顯差異。與親代NzB及NzW相 比，(NZB x NZW)Fl子代小鼠I多型抗dsDNA抗體及抗ssDNA抗體滴度 明顯升高，與親代差異非常顯著(P0.001)。 2.8月齡NZB小鼠IgM型抗dsDNA抗體及IgM型抗ssDNA抗體平均 滴度較高，與NZW差異顯著(P0 .01)。(NZB x NzW)Fl子代I娜型抗 山DNA及抗ssDNA抗體滴度比NZW增高且差異顯著(P0.01)，比NZB 則降低。 3·8月齡NzB、NZW小鼠I步型抗染色質(zhì)抗體及I步型抗組蛋白抗體 平均滴度較低。與親代NZB及NZW相比，(NZB x NZW)Fl子代小鼠I步 型抗染色質(zhì)及組蛋白抗體滴度明顯增高，與親代差異非常顯著(P0 .05)。 4·8月齡NZB小鼠IgM型抗染色質(zhì)抗體及IgM型抗組蛋白抗體平均滴 度較高，與NzW差異顯著(P0.05)。(NZB x NZW)FI子代IgM型抗染色 質(zhì)及抗組蛋白抗體滴度比NZW增高且差異顯著(P0 .05)，比NZB則降 低。 二、SLE模型新西蘭小鼠抗DNA抗體易感基因染色體定位的研究 1.QTL分析確定(NZB xNZW)Fl xNZW回交鼠I步型自身抗dsDNA、 ssDNA抗體遺傳易感基因的定位:I藥型自身抗dsDNA抗體及ssDNA抗體 的易感基因位于小鼠第17染色體近中心端，與微衛(wèi)星DNA遺傳標(biāo)記 D17MIT61、D17MIT22、TNFa、D17Mrr168有較強連鎖，玩ds值均5。這是 小鼠H一2復(fù)合體包括TNFa的基因區(qū)域。 候選的易感基因位點來源的確定:通過比較回交小鼠在易感基因 D17MI竹2 B/W、W/W型之間的血清自身抗dsDNA抗體水平的平均值，經(jīng)t 一檢驗結(jié)果顯示，B/W型W/W型，P值0.001，說明易感基因來源于 NzB;比較翎FaB/W、W/W型之間的血清自身抗dsDNA抗體水平的平均 值，
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

以t檢驗進行組間差異比較。實驗結(jié)果1.新西蘭小鼠抗DNA抗體滴度比較(見表l一l，圖1一2)8月齡NzB小鼠I筍型抗一dsDNA抗體及IgG型抗一ssDNA抗體平均滴度較低。NZW鼠比NZB略高，但無明顯差異。與親代NZB及NZW相比，(NZBxNZW)Fl子代小鼠I嬌型抗dsDNA抗體及抗ssDNA抗體滴度明顯增高，與親代差異非常顯著(P<0.001)。8月齡NzB小鼠I少型抗一dSDNA抗體及IgM型抗一ssDNA抗體平均滴度較高，與NzW差異顯著(p<0.01)。(NZBxNZW)FI子代IgM型抗dsDNA及抗ssDNA抗體滴度比NZW增高且差異顯著，比NZB則降低。

圖1一3)8月齡NzB、Nzw小鼠I筍型抗染色質(zhì)抗體及IgG型抗組蛋白抗體平均滴度較低。與親代NZB及NZW相比，(NZBxNzW)FI子代小鼠IgG型抗染色質(zhì)及組蛋白抗體滴度明顯增高，與親代差異非常顯著(P<0.05)。8月齡NzB小鼠IgM型抗染色質(zhì)抗體及IgM型抗組蛋白抗體平均滴度較高，與NZW差異顯著(P<0.05)。(NZBxNZW)FI子代IgM型抗染色質(zhì)及抗組蛋白抗體滴度比NZW增高且差異顯著，比NZB則降低。表1一2NZB，NzW，NZB/WFI小鼠血清I筍、IgM型抗染色質(zhì)、組蛋白抗體滴度比較(又士SE)Tabl一2ComparisonofthetiterofIgGandIgManti一ehromatinandanti一histoneantibodiesinNZB，NZW

2.5基因分型:根據(jù)PCR產(chǎn)物即擴增的微衛(wèi)星DNA分離片段大小決定回交小鼠基因型。圖2一2顯示(NZBxNZW)FIxNZW回交小鼠的電泳分型，如在PAGE膠上是較亮的二條片段，則為W/W型，三條片段為B/W型。圖2一2(NZBxNZW)xNZW回交小鼠的基因分型Fig.2一2Genot即ingof(NzBxNZw)xNZwbaekcross而ce
【參考文獻】

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本文編號：2878060