發(fā)布時(shí)間：2017-04-05 20:02

  本文關(guān)鍵詞：HIV-1Env特異性單克隆抗體的篩選與異型二價(jià)單克隆抗體的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：中和抗體是HIV-1感染者體內(nèi)保護(hù)性免疫反應(yīng)的一個(gè)重要組成部分，因此尋找具有廣譜中和活性的單克隆抗體一直是HIV-1治療和疫苗研究的一個(gè)重要方向。 近幾年發(fā)展出了幾種高通量、高靈敏度的抗體篩選方法。其中基于B細(xì)胞分選和單細(xì)胞RT-PCR的方法使得篩選到的抗體能更好地反映自然感染狀態(tài)下的抗體形態(tài)，但此方法依賴于流式細(xì)胞儀，而流式細(xì)胞儀非常昂貴，限制了此方法的普遍應(yīng)用。因此，本文采用了操作更簡(jiǎn)易的免疫磁珠細(xì)胞分選來(lái)代替流式細(xì)胞分選，同樣獲得了與HIV-1Gp120抗原特異性結(jié)合的B細(xì)胞，并從獲得的單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增抗體基因，在體外表達(dá)獲得了Env特異性單克隆抗體。 本研究采集HIV-1感染者抗凝全血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，利用生物素標(biāo)記的HIV Gp120抗原與B細(xì)胞膜上的IgG特異性結(jié)合，然后用鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠分選出能夠產(chǎn)生Env特異性抗體的記憶性B細(xì)胞。將獲得的B細(xì)胞稀釋至單細(xì)胞水平，用單細(xì)胞RT-PCR法從記憶性B細(xì)胞中擴(kuò)增抗體的重鏈可變區(qū)基因與輕鏈可變區(qū)基因，并克隆到相應(yīng)的表達(dá)載體中。然后將攜帶重鏈基因的質(zhì)粒與攜帶輕鏈基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得HIV-1特異性人單克隆抗體，并進(jìn)行抗體結(jié)合活性與中和活性的鑒定。結(jié)果從1例我國(guó)HIV-1感染者記憶性B細(xì)胞中篩選出3株對(duì)HIV-1Env抗原有結(jié)合活性的單克隆抗體。其中有2株主要與Gp140和FLSC結(jié)合，1株與Gp120、FLSC和Gp140均可結(jié)合且結(jié)合活性無(wú)明顯差異，但篩選到的單克隆抗體沒(méi)有中和活性。 有研究表明，構(gòu)建針對(duì)不同抗原表位的異型二價(jià)抗體，能提高抗體對(duì)病毒的親和力，中和活性也可能得到增強(qiáng)。由于我們篩選得到Env特異性單抗中有很大一部分沒(méi)有或只有較弱的中和活性，但如果將這些單抗混合應(yīng)用，能否產(chǎn)生協(xié)同作用，發(fā)揮更好的中和效果尚不清楚。因此本文也對(duì)此進(jìn)行一些探索。 首先通過(guò)微量中和實(shí)驗(yàn)分析了本科室前期篩選到的單克隆抗體的協(xié)同中和作用，發(fā)現(xiàn)4組單克隆抗體(IF4/3H2、IF4/CD4、2A5.4/1F4、2A2/3H2)具有協(xié)同中和作用。對(duì)這些抗體進(jìn)行基因改造，將兩個(gè)不同單抗組合成一個(gè)異型二價(jià)單克隆抗體。具體構(gòu)建方法為：首先通過(guò)基因定點(diǎn)突變的方法在重鏈載體恒定區(qū)引入T270Y或Y311T突變，構(gòu)建兩種含有點(diǎn)突變的表達(dá)重鏈恒定區(qū)的載體IgG-T270Y和IgG-Y311T，使這兩種重鏈恒定區(qū)共同表達(dá)時(shí)在突變位點(diǎn)形成一個(gè)“knob-in-hole”的結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)異型二價(jià)單抗的形成。同時(shí)為了便于檢測(cè)，在IgG-T270Y的重鏈恒定區(qū)的CH3區(qū)的C端引入FlAG標(biāo)簽，在IgG-Y311T的重鏈恒定區(qū)的CH3區(qū)C端引入6×His標(biāo)簽。然后采用重疊PCR的方法將單抗的重鏈和輕鏈可變區(qū)連接到一起形成單鏈抗體（single chain Fv，scFv），，將scFv克隆到改造后的重鏈恒定區(qū)表達(dá)載體上，構(gòu)建了3H2-FLAG、1F4-His、CD4-FLAG、2A2-His、2A5.4-FLAG。將攜帶兩種抗體可變區(qū)基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集上清，純化并鑒定異型二價(jià)單克隆抗體是否成功表達(dá)，進(jìn)一步研究其中和活性。結(jié)果只有CD4-FLAG/1F4-His、1F4-His/3H2-FLAG得到了成功表達(dá)，且中和活性比改造前的同型單抗有所提高，CD4-FLAG/1F4-His對(duì)SF162假病毒的IC50為2.3μg/mL；1F4-His/3H2-FLAG對(duì)SF162假病毒的IC50為2.4μg/mL。 綜上所述，利用生物素標(biāo)記HIV Gp120抗原，并用鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，結(jié)合單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)可以成功篩選出抗原特異性的單克隆抗體。部分無(wú)中和活性或中和活性較弱的兩種單抗聯(lián)合應(yīng)用可發(fā)揮協(xié)同作用，利用基因改造的方法與重疊PCR方法可以將抗體改造成一個(gè)異型二價(jià)的雙效單克隆抗體，而且在相同濃度條件下，人工異型二價(jià)雙效抗體比同型抗體的中和活性更強(qiáng)。
【關(guān)鍵詞】：單細(xì)胞PT-PCR 免疫磁珠 單克隆抗體 結(jié)合活性 中和活性
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.91;R392.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 主要英文縮寫詞8-10
• 目錄10-12
• 第1章 緒論12-20
• 1.1 HIV 特點(diǎn)12
• 1.2 中國(guó)艾滋病疫情12
• 1.3 艾滋病疫苗研究進(jìn)展12-14
• 1.4 中和抗體14-16
• 1.4.1 中和抗體的作用14-15
• 1.4.2 中和抗體的篩選15-16
• 1.5 異型二價(jià)單克隆抗體的研究進(jìn)展16-17
• 1.6 課題背景17-18
• 1.7 本研究的內(nèi)容和意義18-20
• 第2章 利用磁珠分選和單細(xì)胞 RT-PCR 篩選 HIV-1 Env 特異性單克隆抗體20-40
• 2.1 材料20-26
• 2.1.1 血樣20
• 2.1.2 細(xì)胞20
• 2.1.3 試劑以及相關(guān)溶液配制20-21
• 2.1.4 合成引物21-26
• 2.1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器26
• 2.2 方法26-34
• 2.2.1 生物素標(biāo)記 Gp120 抗原26-27
• 2.2.2 HIV-1 Env 特異性記憶 B 細(xì)胞的分選27
• 2.2.3 單細(xì)胞 RNA 的制備27
• 2.2.4 抗體重鏈可變區(qū)基因與輕鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增27-29
• 2.2.5 克隆抗體基因29-31
• 2.2.6 抗體基因比對(duì)分析31
• 2.2.7 單克隆抗體的制備與純化31-32
• 2.2.8 ELISA 法檢測(cè)抗體特異性32-33
• 2.2.9 單克隆抗體的中和活性分析33-34
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-37
• 2.3.1 抗體重鏈可變區(qū)基因與輕鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增34-35
• 2.3.2 抗體基因序列分析35-36
• 2.3.3 單克隆抗體與 Env 的結(jié)合活性分析36-37
• 2.3.4 單克隆抗體中和活性分析37
• 2.4 討論37-39
• 2.5 本章小結(jié)39-40
• 第3章 HIV-1 異型二價(jià)單克隆抗體的初步研究40-55
• 3.1 材料40-42
• 3.1.1 細(xì)胞40
• 3.1.2 假病毒40
• 3.1.3 試劑與試劑配制40-41
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器41
• 3.1.5 合成引物41-42
• 3.2 方法42-48
• 3.2.1 單克隆抗體的協(xié)同中和作用42
• 3.2.2 抗體基因改造與克隆42-46
• 3.2.3 異型二價(jià)單克隆抗體的制備與純化46
• 3.2.4 異型二價(jià)單克隆抗體表達(dá)效果鑒定46-47
• 3.2.5 異型二價(jià)單克隆抗體中和活性分析47-48
• 3.3 結(jié)果48-52
• 3.3.1 單克隆抗體間的協(xié)同中和作用48-49
• 3.3.2 表達(dá)載體基因改造49-50
• 3.3.3 抗體可變區(qū)的擴(kuò)增50-51
• 3.3.4 異型二價(jià)單克隆抗體表達(dá)效果鑒定51-52
• 3.3.5 異型二價(jià)單克隆抗體的中和活性鑒定52
• 3.4 討論52-54
• 3.5 本章小結(jié)54-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文60-62
• 致謝62

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