目的 溶酶體是一個形態(tài)變化多樣的運(yùn)動性細(xì)胞器，傳統(tǒng)上呈圓形或橢圓形。近來在不同類型的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種酸性磷酸酶陽性的長管狀溶酶體，稱其為線狀溶酶體(nematolysosome NLY)。超高壓電鏡觀察NLY在細(xì)胞內(nèi)以分支網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形式存在，已有報導(dǎo)，NLY的形成及分布受細(xì)胞內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞外刺激的影響。一些細(xì)胞中可見NLY借分支與圓形溶酶體相連，一般認(rèn)為NLY參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。大量研究證明，在機(jī)體的多種細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺的腺泡細(xì)胞等都有NLY的廣泛存在。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有NLY的分布，在脊髓前角的運(yùn)動神經(jīng)元，其分布在胞體、軸突等，推測NLY參與神經(jīng)元的軸突運(yùn)輸。 紐蛋白(vinculin)是一種細(xì)胞骨架蛋白。細(xì)胞骨架包括微絲、微管及中間絲。其中微絲主要為絲狀肌動蛋白，其由球形的肌動蛋白單體聚合而成。在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，其與vinculin、talin、a-actinin和fodrin等結(jié)合構(gòu)成膜骨架或粘著類型連接等結(jié)構(gòu)。由于上述幾個蛋白均與肌動蛋白結(jié)合存在，又稱其為肌動蛋白結(jié)合蛋白。紐蛋白做為一個粘著連接相關(guān)蛋白，其作用是在細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)間的連接中，將肌動蛋白連接于細(xì)胞膜，其在細(xì)胞的連接、蔓延及固定中有重要的作用。同時，在細(xì)胞外信號向內(nèi)傳導(dǎo)方面也有作用。 溶酶體是由細(xì)胞高爾基復(fù)合體形成的以酸性磷酸酶為主要標(biāo)志酶的細(xì)胞器，其作用是參與細(xì)胞內(nèi)、外物質(zhì)的吞噬與消化。此過程包括如下幾個步驟：初級溶酶體的形成、自噬和異噬的發(fā)生形成早期內(nèi)吞體、早期內(nèi)吞體酸化成熟形成晚期內(nèi)吞體、晚期內(nèi)吞體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體(次級 溶酶體人溶酶體內(nèi)水解酶對吞噬物消化后，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的再利用或形成殘 余體。溶酶體在自噬及異噬過程中可呈線狀、球形或卷曲形，此過程受細(xì)胞 骨架的調(diào)節(jié)，且微絲與微管分別在不同的步驟對其進(jìn)行調(diào)節(jié)。 已有報導(dǎo)，肌動蛋白絲主要促進(jìn)內(nèi)吞體的形成及晚期內(nèi)吞體與溶酶體 的融合，此過程也有肌動蛋白結(jié)合蛋白的參與。用細(xì)胞松弛素（肌動蛋白 絲解聚劑）B或D處理細(xì)胞可見細(xì)胞內(nèi)自噬泡形成減少，認(rèn)為自噬泡的形 成與微絲的聚合與解聚有關(guān)。另有報導(dǎo)，用細(xì)胞松弛素D處理角膜上皮細(xì) 胞可引起紐蛋白分布的改變，提示紐蛋白的分布是微絲依賴的；用佛波醇酯 澤MA）處理細(xì)胞引起線狀溶酶體的形成，也引起紐蛋白免疫熒光染色的變 化。上述研究是否提示紐蛋白與線狀溶酶體的形成有關(guān)？紐蛋白是一個粘 著類型連接相關(guān)蛋白，在異物吞噬過程中是否有紐蛋白的參與？國內(nèi)J尚 未見報導(dǎo)。 本實(shí)驗(yàn)擬采用原代脊髓神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、免疫細(xì)胞化學(xué)、電鏡酶細(xì)胞化學(xué) 及共焦激光掃描顯微鏡等方法對脊髓神經(jīng)元紐蛋白的表達(dá)及其與肌動蛋白 絲之間的關(guān)系、線狀溶酶體的分布及其影響因素及紐蛋白與線狀溶酶體之 間的關(guān)系進(jìn)行研究。從而，對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白的分布、作用及線狀 溶酶體的形成等有更深的了解；填補(bǔ)細(xì)胞學(xué)理論及細(xì)胞骨架蛋白該方面研 究的空白。 實(shí) 驗(yàn) 方 法 1．原代細(xì)胞培養(yǎng)及施加處理因素：取出生12 h內(nèi)乳鼠，無菌取脊髓， 剪碎、消化、離心，加 DMEM制成細(xì)胞懸液，加人預(yù)先置有蓋玻片及ACLAR 膜的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。待細(xì)胞成熟，分別向培養(yǎng)基中加人細(xì)胞松弛素D＊D 組）、PMA（PMA組）及DMSO（對照組）。 2．免疫組化ABC法及免疫熒光法染色：取長有神經(jīng)細(xì)胞的蓋玻片及 ACLAR膜，用4％多聚甲醛固定后，分別進(jìn)行小鼠抗人hVIN－1的免疫組 化ABC法、免疫熒光法染色及組織蛋白酶D的免疫熒光法染色，然后進(jìn)行 hVINJ的免疫電鏡顯示，以顯示紐蛋白及組織蛋白酶D在原代培養(yǎng)的脊 髓神經(jīng)元的分布。在光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡下觀察、照相。 3．ACP酶的光、電鏡酶細(xì)胞化學(xué)方法顯示：取長有細(xì)胞的蓋玻片及 ·二· ACLAR膜，2％多聚甲醛刀．25％戊二醛的固定液固定，ACP酶孵育液中孵 育，80分，37℃，孵育液配方采用［mori’s的方法配制，硫化胺顯色，甘油明 膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察、照像。見陽性結(jié)果后對ACLAR膜培養(yǎng)的脊髓神 經(jīng)元進(jìn)行常規(guī)電鏡標(biāo)本制備，原位倒扣包埋、聚合。聚合后剝?nèi)CLAR 膜，顯微鏡下定位脊髓神經(jīng)元，超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾單染，透射電鏡觀 察、照相。 4．免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)：取出長有神經(jīng)細(xì)胞的蓋玻片用4％多聚甲醛 固定 15 分鐘，正常驢血清（donkey八 1：50）及羊血清（Sheep）（1：50）混勻， 封閉非特異性染色，一抗孵育：將小鼠抗人組蛋白單克隆抗體門：400）及兔 抗人組織蛋白酶抗體（工作液）混勻，滴于蓋玻片上，濕室，4℃過夜，二抗孵 育：將FITC標(biāo)記的donkey－anti·－Rabbit IgG（綠）（二：50）及Texas－Red標(biāo) 記的 sheep－anh－Mouse IsG紅色）（l：50）混勻，滴于藍(lán)玻片上，濕室，Zh， 室溫對W洗后，甘油一PBS封片，共焦激光掃描顯微鏡（eica TCS－SPZ，北 京醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞所／ 643nr。雙通道激發(fā)，觀察結(jié)果，計算機(jī)存盤。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．相差顯微鏡觀察 原
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

?窬??植糠糯笙允九Φ鞍自詘?誓誄釋?裱?植糽ooK圖1一16免疫電鏡顯示紐蛋白在CD處理培養(yǎng)神經(jīng)元的分布20K可見紐蛋白在細(xì)胞膜下的分布明顯減少，且胞質(zhì)及突起內(nèi)出現(xiàn)空泡(*)及斷裂。42

圖1一巧培養(yǎng)神經(jīng)元局部放大顯示紐蛋白在胞質(zhì)內(nèi)呈網(wǎng)格樣分布looK圖1一16免疫電鏡顯示紐蛋白在CD處理培養(yǎng)神經(jīng)元的分布20K可見紐蛋白在細(xì)胞膜下的分布明顯減少，且胞質(zhì)及突起內(nèi)出現(xiàn)空泡(*)及斷裂。42

圖2一5原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元中ACP酶分布可見部分高爾基復(fù)合體板層呈陽性反應(yīng)(t)。30K圖2一6CD處理原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元中ACP酶陽性的溶酶體加K可見核周線狀溶酶體增多(t)。46
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2870757