本文關(guān)鍵詞：呼吸道合胞病毒感染人肺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對(duì)TLR3表達(dá)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）為副粘病毒科肺炎病毒屬，，是有包膜非節(jié)段性的單負(fù)鏈RNA病毒，也是引起世界范圍內(nèi)嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染的最常見(jiàn)病原體，并與后來(lái)的哮喘發(fā)生發(fā)展和肺功能異常有關(guān)。RSV感染可通過(guò)氧化應(yīng)激（oxidative stress）造成機(jī)體的損傷，引起機(jī)體的一些病理生理變化，從而引起一些疾病的發(fā)生；如RSV感染呼吸道上皮細(xì)胞后，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子、趨化因子、活性氧等生物活性介質(zhì)，導(dǎo)致嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎、肺炎、哮喘等疾病的發(fā)生。目前國(guó)內(nèi)氧化應(yīng)激研究主要集中在病毒與氧化應(yīng)激的關(guān)系、對(duì)患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的認(rèn)識(shí)上，而對(duì)氧化應(yīng)激所介導(dǎo)的Toll樣受體的研究相對(duì)較少。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）為I型跨膜蛋白，是識(shí)別病原體的重要受體，它們識(shí)別細(xì)菌、病毒或環(huán)境中的配體，啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)。TLR3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與激活呼吸道上皮細(xì)胞，分泌大量炎癥免疫相關(guān)細(xì)胞因子，在RSV感染引起肺炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本文通過(guò)探討RSV感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生并給予抗氧化劑和氧化促進(jìn)劑進(jìn)行處理，初步研究RSV感染時(shí)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激影響TLR3水平及其主要信號(hào)分子的表達(dá)變化，為研究RSV的致病進(jìn)行有效預(yù)防和控制等提供新的思路和理論依據(jù)。 目的：探討RSV感染人肺上皮細(xì)胞（A549細(xì)胞）誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生后，Toll樣受體3（Toll-like receptor3，TLR3）的水平變化，初步研究氧化應(yīng)激對(duì)TLR3活化及其主要信號(hào)分子的影響。研究該調(diào)節(jié)途徑可能為RSV感染的致病機(jī)理、對(duì)所致疾病的有效預(yù)防和治療等提供新的思路和重要的研究基礎(chǔ)，有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 方法：以RSV感染體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞，并分別給予氧化劑和抗氧化劑進(jìn)行處理，再以相同RSV感染，于感染后4h、8h、12h和24h不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清，并以未感染病毒的A549細(xì)胞為正常對(duì)照組。①用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)不同組別TLR3、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κ-binding,NF-κB）p65、干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor3, IRF3）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）mRNA的表達(dá)量變化；②用WST-1法檢測(cè)SOD活力；③硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中一氧化氮（nitric oxide,NO）的含量；④化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中活性氧指標(biāo)羥自由基（hydroxy radical，OH·）的水平。 結(jié)果：①在mRNA轉(zhuǎn)錄水平，在RSV感染不同時(shí)間點(diǎn)上調(diào)TLR3、NF-κB基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，下調(diào)IRF-3、SOD基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，而且其表達(dá)量與感染之間有時(shí)間依賴性關(guān)系；在加入抗氧化劑NAC后，TLR3、NF-κB的表達(dá)雖有上調(diào)，但表達(dá)量都比感染組同時(shí)間點(diǎn)下降，IRF-3、SOD的mRNA比感染組相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量下調(diào)不明顯。在加入氧化劑H_2O_2后，TLR3、NF-κB的mRNA表達(dá)比感染組相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量明顯升高，且升高有差異性，IRF-3、SOD的mRNA比感染組相同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量下調(diào)更明顯，且降低有差異性。②WST-1法檢測(cè)SOD：RSV感染組隨時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)SOD活力逐漸下降，給予抗氧化劑NAC處理后，SOD活力與感染組相比下調(diào)不明顯；給予氧化劑H_2O_2處理后，SOD與感染組相比表達(dá)明顯下調(diào)；③硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清NO的含量：RSV感染組NO含量逐漸升高，在給予抗氧化劑NAC處理后NO含量與感染組同一時(shí)間點(diǎn)相比降低；給予氧化劑H_2O_2處理后，NO的含量與感染組相比明顯升高；④化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中活性氧指標(biāo)OH·含量：在RSV感染組，隨著感染時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)OH·的含量逐漸升高，在給予抗氧化劑NAC后，OH·的含量與感染組相比是降低的；給予氧化劑H_2O_2處理后，OH·的含量與感染組相比明顯升高。以上結(jié)果表明NAC和H_2O_2分別起到了抑制和激動(dòng)氧化應(yīng)激的作用，從而影響了TLR3轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，進(jìn)一步影響了下游的一些主要炎性因子變化。 結(jié)論：RSV感染A549細(xì)胞可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，在感染組，RSV感染可使TLR3表達(dá)上調(diào)；在加入抗氧化劑NAC后，再行相同RSV感染，雖上調(diào)TLR3的表達(dá)，但表達(dá)量比感染組相同時(shí)間點(diǎn)的下降；在加入氧化劑H_2O_2后，再行相同RSV感染，TLR3的mRNA表達(dá)比感染組相同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量明顯升高。用氧化劑和抗氧化劑處理后，TLR3及其下游主要信號(hào)分子的表達(dá)出現(xiàn)明顯的變化，表明呼吸道合胞病毒感染活化TLR3的表達(dá)可能是通過(guò)氧化應(yīng)激途徑來(lái)調(diào)節(jié)的。
【關(guān)鍵詞】：呼吸道合胞病毒 核轉(zhuǎn)錄因子κB 氧化應(yīng)激 Toll樣受體3 A549細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.14
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 1 前言14-16
• 2 材料和方法16-27
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 病毒16
• 2.1.2 細(xì)胞16
• 2.1.3 試劑16-17
• 2.1.4 儀器和設(shè)備17
• 2.2 方法17-27
• 2.2.1 溶液的配制17-19
• 2.2.2 病毒增殖及病毒感染量測(cè)定19
• 2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒接種19
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)分組與標(biāo)本收集19-20
• 2.2.5 A549 細(xì)胞培養(yǎng)上清中 OH·檢測(cè)20-21
• 2.2.6 TLR3、NF-κB p65、IRF-3、SOD 在 RSV 感染組和 NAC，H2O2 干預(yù)組的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)21-24
• 2.2.6.1 A549 細(xì)胞總 RNA 提取21
• 2.2.6.2 RNA 定性與定量分析21-22
• 2.2.6.3 兩步 RT-PCR 方法檢測(cè)22-24
• 2.2.6.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 結(jié)果24
• 2.2.7 A549 細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）蛋白的微板法檢測(cè)24-26
• 2.2.7.1 總蛋白樣本制備24
• 2.2.7.2 Lowery 法蛋白定量24-26
• 2.2.7.3 操作步驟26
• 2.2.7.4 計(jì)算公式26
• 2.2.8 A549 細(xì)胞培養(yǎng)上清中 NO 的檢測(cè)26-27
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理27
• 3 結(jié)果27-39
• 3.1 病毒半數(shù)感染量滴定27-28
• 3.2 RSV 感染 A549 細(xì)胞培養(yǎng)上清中 OH·的含量變化以及給予抗氧化劑和氧化劑干預(yù)后OH·含量的變化28
• 3.3 TLR3、NF-κB p65、IRF-3、SOD 在 RSV 感染組和 NAC，H_2O_2 干預(yù)組的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化28-37
• 3.3.1 TLR3 mRNA 在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)29-31
• 3.3.2 NF-κB p65 mRNA 在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)31-33
• 3.3.3 IRF-3 mRNA 在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)33-35
• 3.3.4 SOD mRNA 在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)35-37
• 3.4 RSV 感染 A549 細(xì)胞上 SOD 活力的變化以及給予抗氧化劑和氧化劑干預(yù)后 SOD 的變化37-38
• 3.5 RSV 感染 A549 細(xì)胞培養(yǎng)上清中 NO 的含量變化以及給予抗氧化劑和氧化劑干預(yù)后 NO含量的變化38-39
• 4 討論39-43
• 5 結(jié)論43
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 附錄48-49
• 致謝49-50
• 綜述50-58
• 參考文獻(xiàn)55-58

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4 曾憲成;馬t

本文編號(hào)：286158