免疫抑制劑的應(yīng)用使器官移植獲得了很大的發(fā)展，然而，終身免疫抑制所帶來的毒性、機會感染及腫瘤的高發(fā)病率成為臨床器官移植所面臨的重要問題。供體特異性器官移植免疫耐受，即在接受組織配型不相容的器官移植或加短療程治療后達到不用藥(常規(guī)免疫抑制劑)、不排斥、不感染的“三不狀態(tài)”是器官移植發(fā)展的方向。免疫干預(yù)新策略的應(yīng)用，有可能給上述問題帶來解決之道。與全身性給予免疫抑制性生物制劑相比，基因治療技術(shù)在器官移植領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用價值。針對移植物局部產(chǎn)生的免疫抑制分子可能會提高它們的治療效果，并減少它們對全身的影響。 可溶性重組融合蛋白huCTLA4-Ig是一種新穎的免疫抑制劑，分子量約為92KD，由人CTLA-4分子的胞膜外區(qū)與人IgG1的Fc段(鉸鏈區(qū)與恒定區(qū))融合形成，能牢固地與B7分子結(jié)合，阻斷CD28介導(dǎo)的共刺激信號，導(dǎo)致免疫反應(yīng)的抑制。給予huCTLA4-Ig，短期阻斷CD28介導(dǎo)的共識別可導(dǎo)致MHC不匹配的嚙齒類模型中移植物的長期存活與耐受。腺病毒介導(dǎo)的針對移植物的免疫調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)移，是調(diào)控免疫反應(yīng)的新策略。目前，關(guān)于基因轉(zhuǎn)移huCTLA4-Ig誘導(dǎo)同種異體移植物耐受的研究，國外僅有少數(shù)實驗室開展，國內(nèi)未見報道。 我們采用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)，自行構(gòu)建攜帶huCTLA4-Ig的重組腺病毒，通過先體外后體內(nèi)(ex vivo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，于供肝冷保存時，將該治療基因?qū)氪笫笠浦哺危蛊溆谝浦哺尉植勘磉_，觀察其抑制排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)大鼠移植肝免疫耐受的作用。通過本研究，旨在探討：在無常規(guī)免疫抑制劑應(yīng)用的情況下，先體外后體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移免疫抑制分子獲得同種異體移植物耐受的可能性。 主要實驗結(jié)果如下： 1．成功構(gòu)建了攜帶融合基因huCTLA4-Ig的重組腺病毒，滴度為6.0×10~(13)PFU／L。該重組病毒在體外能有效感染正常肝細胞株L-O2，受感染細胞能表達、分泌可溶性的重組融合蛋白huCTLA4-Ig； 2．建立了大鼠BN(RT1~n)→LEW(RT1~l)原位肝移植同種異體排斥模型，該模 博士學(xué)位論義 基因轉(zhuǎn)移hU＊＊LA個ig誘導(dǎo)大鼠移植肝免疫耐受的實驗研究 中文摘要 型排斥反應(yīng)時間較為恒定，在不應(yīng)用免疫抑制劑的情況下，生存期＜3周（平均生存時 問人］6 6士 2．5 d，11一引； 3．供肝冷保存時，采用血管夾技術(shù)＊lamp technique）經(jīng)門靜脈灌注攜帶融合基 因hllCTLA4dg的重組腺病毒，于術(shù)后3天、7天能定性檢測到hllCTLA4Ig在受體外 劃血卜1。的外分泌性表達及供肝J］－I‘細胞內(nèi)的表達，以后迅速下降，至術(shù)后2 8天幾乎不能 檢測到。 個訛注亞組腺炳邊組（A組，n—5）或灌注杉引IZ‘報告基囚GFP的亞組腺病毒組（B 縱，；。一4），受仰鼠均在3川內(nèi)死亡，平均生存時問A組為16石土2．5天，B組為15．5 土3．1大，兩組問無顯著性差異V－0．35，尸＞0刀5八 而灌注攜帶融合基因＊＊＊＊A個ig 的重組腺病毒組 ＊組，fi—5）受體鼠均能獲得長期生存（＞150天）；A組與C組間、 B組與C組間，生存期均有顯著性差異’（P＜0刀1人 A組與B組，在術(shù)后8天行移植肝活檢，病理學(xué)檢查證實：移植肝均發(fā)生嚴重的 細胞性排斥。C組，移植肝病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)：術(shù)后8天，可見移植肝輕、中度的匯管 區(qū)炎癥，但組織損傷程度顯著減輕：術(shù)后150天，單核細胞浸潤亦能觀察到，但膽管 保存完好，無血管損傷證據(jù)。 術(shù)前大鼠血 ＊1卜2濃度為362們土45．84 n＊幾；肝移械 術(shù)后，＊ 寧1卜2的濃度在 A、B組中即升高到較高水平（約為術(shù)前的1．5－2．5倍），相反地，在C組中其始終維 持在一個較低水平（按近或低于術(shù)前水平），術(shù)后3、7天，血清IL－二的濃度在A、C 組；句及 B、C組 l”。J差異均非常顯著（P＜0．of）。 結(jié)論：本研究在國內(nèi)率先建立了簡便有效的針對血管化移植物的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)， 該系統(tǒng)中重組腺病毒在冷保存時能有效感染供肝，并獲得融合基因的分泌性表達。移 植肝局部產(chǎn)生的可溶性融合蛋白hllCTLA4Ig，能抑制同種異體免疫反應(yīng)，在不使用常－ 規(guī)兔疫抑制劑情況下，獲得大鼠同種異體移植肝的長期存活。初步證實本研究建立的 器官移植基因治療方法具有簡便、有效的特點。本研究對于臨床肝移植具有一定的潛 在應(yīng)用價值，為免疫調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)用于肝移植臨床，以防治移植肝術(shù)后免疫排斥 反應(yīng)的發(fā)十，仆狄衍移伙川’的見疫耐受捉儀了初步的實驗依抓。 【關(guān)鍵詞】肝移植;基因轉(zhuǎn)移;免疫耐受;CTLA4-Ig
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R392.1
【部分圖文】：

7一Cn28共刺激通路及其調(diào)控

博士學(xué)位論文基因轉(zhuǎn)移huCTLA4一Ig誘導(dǎo)大鼠移植肝免疫耐受的實驗研究第一部分6戶八era世記nofJR戶‘omb仍anrAden。~‘UsingAdE日鄧TM

本疊而.匆tO加.mPll目.d份。。m創(chuàng)n.時:dno，l丫u.圖1一2.應(yīng)用AdEasyTM系統(tǒng)產(chǎn)生重組腺病毒的主要步驟:①將外源基因克隆到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒;②在大腸桿菌BJ5183中同源重組，獲得重組腺病毒質(zhì)粒;@重組腺病毒在293細胞內(nèi)的包裝及增殖。(引自pNAs，1，，8，95:250，一14).
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 謝學(xué)羿,陳規(guī)劃,黃潔夫;二袖套法建立大鼠原位肝移植模型的初步體會[J];肝膽外科雜志;1999年06期

2 陳嘉薇,陳大志;肝臟移植排斥反應(yīng)的病理診斷和分級[J];中華器官移植雜志;1999年02期

本文編號：2851878