登革熱是由登革病毒引起，經(jīng)媒介伊蚊傳播，在世界上流行最廣泛的一種蟲媒病毒性疾病�？刂泼浇橐廖檬欠乐蜠F最有效的方法，但傳統(tǒng)上控制登革熱媒介的措施存在許多局限性，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)為蚊媒疾病的防治提供了一個(gè)新的思路。本研究擴(kuò)增和克隆登革病毒C基因和prM基因，構(gòu)建了昆蟲表達(dá)載體pBhspEGFP，將prM基因以3種不同表達(dá)形式重組入昆蟲表達(dá)載體，Western Blot和熒光顯微鏡觀察證明在白紋伊蚊C6／36細(xì)胞中成功表達(dá)了prM-EGFP融合蛋白。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后C6／36細(xì)胞表現(xiàn)出對登革病毒入侵的抵抗性，從而復(fù)制出C6／36細(xì)胞對登革病毒的細(xì)胞內(nèi)免疫現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)無論是否表達(dá)prM蛋白，只要有prM基因轉(zhuǎn)錄可引起細(xì)胞內(nèi)免疫現(xiàn)象；prM基因正義和反義轉(zhuǎn)錄形式均可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)免疫；并探討其形成機(jī)制可能是通過RNA干擾作用而產(chǎn)生。構(gòu)建了以轉(zhuǎn)座子piggyBac因子為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因載體pB[PUBnls EGFP-prM]，PCR和Southern Blot證明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體可以將EGFP-prM基因整合入在蚊蟲基因組中。驗(yàn)證了轉(zhuǎn)座子piggyBac因子、啟動(dòng)子polyubiquitin可以在白紋伊蚊中發(fā)揮作用，為進(jìn)一步構(gòu)建不傳播登革病毒的轉(zhuǎn)基因白紋伊蚊奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R384.1;R392
【部分圖文】：

2.2質(zhì)粒pEGFp一3的Ndel和Bgl11雙酶切質(zhì)粒pEGFp一N3的Ndel和Bgl11雙酶切后產(chǎn)生與設(shè)計(jì)相符的377Pb和4.3kb兩個(gè)片段(見圖4)。圖4質(zhì)粒pEGFP一N3雙酶切后1.0%凝膠電泳圖Fig4.ResrtietionnaalysisofPlasmidPEGFP一N3(1.0%gaarosegeleleeortPhoresis)LnaeMI，MZstnaddarweightmarker，Lnael，2.PrMgenereeombinantundigestedPlasmid，Lnae3，4PlasmiddigestedbyNdel和Bgl112.2質(zhì)粒phspBac的Apal和EeoRI雙酶切質(zhì)粒phPsBac的APal和EocRI雙酶切產(chǎn)物在1.0%凝膠電泳中呈現(xiàn)在580bp和5

pB[hspEGFP]的測序鑒定化大腸桿菌JM109后，分別挑取3個(gè)克明3個(gè)克隆中有2個(gè)啟動(dòng)子hsp7o呈正向插入。式pMr的表達(dá)載體pBlhsp一prM一EGFPIfs、pMr一uft、pMr一nati分別與pMr一bf配合電泳顯示pMr一ofs、pMr一uft、pMr一nati分0bp的擴(kuò)增帶。

BPnati經(jīng)APal和助刀工雙酶切產(chǎn)生550Pb的插入片段，與PrM基因相符。以重組質(zhì)粒為模板做PRC鑒定，均擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)大小相符的基因片段(見圖7)。因此證明所獲得的重組質(zhì)粒已成功地插入了目的基因。圖7重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定Fig2.PCRnadRestrictionanalysisofreeombinnatPlasmid(1.2%gaarosegelelecrtoPhoersis)LnaeM1.stnaddarweightmkarerLnael，2.PCRnaalysisnadResrtietionnaalysisereombinnatPlasmidPBPrM，Lnae3，5PCRnaalysisnadResrtictionnaalysisercombinnatPlasmidPBunt，Lnae4，6PCRnaalysisandRestrietionanalysisereombinnatPlasmidPBnati4.不同表達(dá)載體pBlbsp一PrM一EGFPI在白紋伊蚊細(xì)胞C6136中的表達(dá)4.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA提取提取的蚊蟲細(xì)胞總NRA經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳顯示清晰的185、285兩條泳帶，證明NRA完整無降解(見圖8)。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 胡珍;尚偉龍;張俊磊;朱軍民;楊杰;劉佳;方昕;袁文常;程航;胡曉梅;饒賢才;;登革-日本腦炎嵌合病毒樣顆粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建[J];中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2011年08期

2 丁細(xì)霞;狄飚;車小燕;;抗Ⅳ型登革病毒NS1單克隆抗體的制備及特性鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年07期

3 付春云;方丹云;劉巖;喻治準(zhǔn);江漢寧;江麗芳;周俊梅;;登革病毒3型病毒樣顆粒在酵母體內(nèi)的表達(dá)與鑒定[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2011年06期

4 高洪麗;李興華;田疆;方丹云;付強(qiáng);劉巖;周俊梅;周經(jīng)姣;江麗芳;;登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1群特異性單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2011年06期

5 肖曉玲;湛柳華;羅曉風(fēng);羅雷;曾維斌;周德謙;劉杰;;廣州市越秀區(qū)一起家庭登革Ⅲ型病毒感染疫點(diǎn)調(diào)查[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2011年08期

6 呂志;付士紅;李銘華;張松;高春代;高曉艷;鄧掌;陳維欣;梁國棟;;中國新疆部分地區(qū)蚊傳黃病毒感染調(diào)查[J];疾病監(jiān)測;2011年06期

7 鄭夔;王洪敏;黃吉城;夏文英;洪燁;李小波;師永霞;幸蘆琴;郭波旋;;臨床標(biāo)本中未知病毒基因芯片檢測方法探索[J];華南預(yù)防醫(yī)學(xué);2011年04期

8 朱臨;孫立新;葉松;陸軍;胡紅霞;朱國強(qiáng);;蚊媒病毒檢測技術(shù)研究綜述[J];淮南職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年03期

9 王立華;何劍峰;;基孔肯雅熱的流行現(xiàn)況及其研究進(jìn)展[J];華南預(yù)防醫(yī)學(xué);2011年03期

10 ;[J];;年期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 葛春喜;白紋伊蚊對登革病毒細(xì)胞內(nèi)免疫的研究[D];中山大學(xué);2002年

2 杭小同;登革病毒感染診斷方法的研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2010年

3 肖維威;登革病毒檢測基因芯片的研制研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 劉然;登革病毒非編碼3’亞基因組RNA的鑒定與功能分析[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

5 姬廣輝;無感染增強(qiáng)的廣譜抗登革病毒中和抗體的構(gòu)建及機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

6 陳水平;登革病毒prM-E基因的多價(jià)重組質(zhì)粒DNA的免疫原性研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

7 張俊磊;登革2型病毒與內(nèi)皮細(xì)胞表面整合素β_3相互作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

8 王明連;登革病毒NS5蛋白在原核細(xì)胞中的活性表達(dá)及其拮抗肽篩選[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

9 楊杰;登革病毒EDⅢ蛋白的表達(dá)、純化及其與ECV304細(xì)胞相互作用蛋白的篩選與鑒定研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

10 朱武洋;衣殼蛋白基因突變對登革病毒生物學(xué)性質(zhì)的影響[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鄒林;登革病毒NS1抗原檢測技術(shù)的初步研究[D];暨南大學(xué);2010年

2 溫筱蕓;細(xì)胞因子在登革病毒感染人皮膚成纖維細(xì)胞中的作用[D];暨南大學(xué);2004年

3 張俊磊;登革病毒廣州2002年流行株的分離鑒定及登革病毒感染ECV304細(xì)胞分子機(jī)制的初探[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 馬秀芝;云南西南部地區(qū)健康人群登革病毒血清抗體調(diào)查及白紋伊蚊rDNA-ITS2序列初步分析[D];大理學(xué)院;2012年

5 王嘉麗;微絲骨架在登革病毒感染ECV304細(xì)胞中作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

6 段鴻元;登革3型病毒prME和NS1多基因重組質(zhì)粒DNA免疫原性增強(qiáng)效果觀察[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

7 陳宗濤;小鼠抗登革病毒2型單克隆抗體的制備及特性的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

8 秦成峰;登革病毒衣殼蛋白靶向抗病毒作用的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

9 柴克生;營區(qū)蚊、蠅、鼠的分布、攜帶病原及防制研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

10 盧業(yè)成;2003年廣州地區(qū)登革病毒感染快速診斷及可能來源分析[D];暨南大學(xué);2005年

本文編號：2844456