本文關(guān)鍵詞：Notch1對(duì)PC12細(xì)胞自噬和生物學(xué)特性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Notch基因在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中都廣泛存在且高度表達(dá),并且在不同物種間都具有高度的進(jìn)化保守性。Notch信號(hào)通路的功能復(fù)雜多樣,調(diào)控正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化,決定細(xì)胞的命運(yùn),參與調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的方方面面,在哺乳類動(dòng)物中,Notch參與造血、T細(xì)胞發(fā)育、血管生成等重要生理過(guò)程,并與腫瘤形成和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)室采用Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng),建立了可動(dòng)態(tài)調(diào)控NICD基因表達(dá)的PC12-Notch1細(xì)胞系,克服了傳統(tǒng)研究方法不能準(zhǔn)確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Notchl表達(dá)的缺點(diǎn),有利于更好的研究Notchl對(duì)PC12細(xì)胞的作用以及其中的分子機(jī)制。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用,且已有研究表明Notch與自噬的信號(hào)調(diào)控有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在PC12-Notchl細(xì)胞系的基礎(chǔ)上研究PC12細(xì)胞內(nèi)Notchl基因?qū)?xì)胞內(nèi)自噬和細(xì)胞生物學(xué)特的影響及PI3K-AKT-MTOR通路hIRNA的變化,探討可能的調(diào)控機(jī)制。 目的 四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素(DOX)動(dòng)態(tài)調(diào)控Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)PC12-Notchl細(xì)胞中Notch1胞內(nèi)段(NICD)的表達(dá),檢測(cè)在Notchl不同的表達(dá)水平上PC12細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞內(nèi)自噬水平的變化。研究Notchl基因?qū)?xì)胞內(nèi)自噬和細(xì)胞生物學(xué)特的影響及PI3K-AKT-MTOR通路mRNA的變化,探討其可能的調(diào)控機(jī)制。 方法 1.檢測(cè)PC12-Notchl細(xì)胞內(nèi)NICD的表達(dá)：復(fù)蘇PC12-Notchl細(xì)胞,取兩代之后的細(xì)胞接種六孔板,加入四環(huán)素DOX(1ug/m1)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)NICD的表達(dá)。根據(jù)DOX誘導(dǎo)時(shí)間分為六各不同時(shí)間組(分別是Oh,12h,24h,36h,48h,60h).熒光倒置顯微鏡下觀察不同誘導(dǎo)時(shí)間組內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá),每孔計(jì)數(shù)三個(gè)視野內(nèi)的EGFP陽(yáng)性表達(dá)率,最后計(jì)算平均值,得出各誘導(dǎo)時(shí)間組EGFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。消化各組細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀測(cè)量各組細(xì)胞內(nèi)NICD的熒光表達(dá)強(qiáng)度,繪制DOX不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)PC12-notch1細(xì)胞內(nèi)NICD表達(dá)趨勢(shì)圖。 2.檢測(cè)高表達(dá)NICD的PC12-Notch1細(xì)胞周期和凋亡：將PC12-Notchl細(xì)胞接種六孔板,加入四環(huán)素DOX (lug/ml)誘導(dǎo)NICD的表達(dá),仍舊根據(jù)DOX誘導(dǎo)時(shí)間分為六各不同時(shí)間組(分別是Oh,12h,24h,36h,48h,60h).消化各時(shí)間組的細(xì)胞,上流式儀測(cè)量各時(shí)間組NICD不同的表達(dá)水平上細(xì)胞內(nèi)周期及凋亡率的變化。 3. PC12-Notch1細(xì)胞自噬的檢測(cè)：消化各時(shí)間組的細(xì)胞并提取蛋白質(zhì),Westernblot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3B,Beclinl,ATG7,ATG5的表達(dá)。軟件分析曝光條帶灰度值并比較各時(shí)間組細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白的表達(dá)差異。 4.熒光定量PCR檢測(cè)PC12-Notchl細(xì)胞內(nèi)自噬信號(hào)通路：提取各時(shí)間組細(xì)胞內(nèi)RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,熒光定量PCR檢測(cè)PI3K、AKT、mTOR等基因的表達(dá),比較在不同分組間mRNA表達(dá)差異。 結(jié)果 1.熒光表達(dá)量：加入6OX誘導(dǎo)后,在顯微鏡下觀察PC12-Notchl內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)量和流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)0h組細(xì)胞未觀察到綠色熒光,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,從12h組,24h組再到36h組細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)量逐漸增加,細(xì)胞熒光表達(dá)率分別為20%,55%,71%。在誘導(dǎo)36h時(shí)熒光表達(dá)強(qiáng)度和熒光表達(dá)率達(dá)到最高,之后再持續(xù)給藥誘導(dǎo)48h,60h時(shí)發(fā)現(xiàn)NICD熒光表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度有所下降,但都高于0h組,熒光表達(dá)率分別為63%,59%。各誘導(dǎo)時(shí)間組細(xì)胞內(nèi)NICD的熒光強(qiáng)度都顯著高于非誘導(dǎo)組。 2.細(xì)胞周期和凋亡：在PC12-Notch1DOX非誘導(dǎo)細(xì)胞組中,細(xì)胞的凋亡率維持較低水平。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加直到最大誘導(dǎo)時(shí)間60h組,PC12-Notch1細(xì)胞凋亡率是逐漸升高的,60h時(shí)凋亡率達(dá)到最高,統(tǒng)計(jì)分析各誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組相比都具有顯著向差異。在PC12-Notch1DOX非誘導(dǎo)組細(xì)胞中,細(xì)胞的S期較高。從0h組開始隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加直到最大誘導(dǎo)時(shí)間60h組,PC12-Notch1細(xì)胞周期中S期逐漸降低,60h組S期達(dá)到最低。 3.細(xì)胞自噬水平的變化：Westernblot檢測(cè)各時(shí)間組細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志蛋LC3B,Beclin1,ATG7,ATG5的表達(dá)。應(yīng)用軟件Image對(duì)曝光條帶灰度值分析得出這四種自噬蛋白的表達(dá)量先隨DOX誘導(dǎo)時(shí)間增加而升高到36h達(dá)到最高,說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞自噬水平達(dá)到高峰,之后再持續(xù)誘導(dǎo)48h,60h時(shí)發(fā)現(xiàn)灰度值呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì),但都高于Oh組；方差分析得,各誘導(dǎo)時(shí)間組細(xì)胞內(nèi)LC3B,Beclin1,ATG7,ATG5的表達(dá)量都顯著高于非誘導(dǎo)組。 4.熒光定量PCR檢測(cè)DOX不同誘導(dǎo)時(shí)間組PC12細(xì)胞內(nèi)基因PI3K、AKT、 mTOR、GADPH的表達(dá)。分析結(jié)果可得：各個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)PI3K、AKT、 mTOR的表達(dá)比非誘導(dǎo)組明顯降低,且具有顯著差異(P0.01)。 結(jié)論 1.利用強(qiáng)力霉素(DOX)動(dòng)態(tài)調(diào)控Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)PC12-Notch1胞中Notch1胞內(nèi)段NICD的表達(dá),其效能與誘導(dǎo)時(shí)間密切相關(guān)。 2.隨著PC12細(xì)胞內(nèi)NICD表達(dá)量增高,PC12細(xì)胞的細(xì)胞周期受到抑制增強(qiáng),細(xì)胞凋亡率逐漸升高。 3.PC12細(xì)胞內(nèi)NICD表達(dá)量增高,細(xì)胞內(nèi)自噬激活,其機(jī)制與PI3K-AKT-MTOR通路抑制有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：PC12 自噬 Notch1 mTOR 凋亡
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文~.略詞表11-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-27
• 結(jié)果27-44
• 討論44-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-52
• 綜述52-66
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和攻讀碩士期間發(fā)表論文66-67
• 致謝67

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：284331