發(fā)布時間：2017-04-03 15:05

  本文關(guān)鍵詞：淡色庫蚊miR-279-3p和miR-4448與抗藥性關(guān)系研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蚊傳播包括瘧疾、登革熱、西尼羅熱等在內(nèi)的多種蚊媒病�；瘜W(xué)防治一直是蚊媒綜合治理策略中的主要方法。然而隨著化學(xué)殺蟲劑的長期大量使用,蚊對多種殺蟲劑均產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。蚊抗藥性是由多基因共同決定的,其中細胞色素P450單加氧酶、酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等基因表達量的改變與代謝抗性密切相關(guān),然而這些解毒代謝酶基因的調(diào)控機制卻鮮有報道。本課題組前期通過solexa測序的方法比較了淡色庫蚊溴氰菊酯敏感和抗性品系的microRNA表達譜。本課題選取了在溴氰菊酯敏感和抗性品系中具有顯著表達差異的miR-279-3p和miR-4448,對其調(diào)控抗藥性的機制進行進一步研究。 本研究首先克隆并測定淡色庫蚊miR-279-3p和miR-4448前體pre-miR-279-3p和pre-miR-4448的序列；并采用實時熒光定量PCR驗證兩者在溴氰菊酯敏感和抗性品系中的表達差異。隨后,預(yù)測兩者的靶基因分別為CYP325BB1和CYP4H31,并檢測其在敏感和抗性品系中的表達水平；運用雙熒光報告系統(tǒng)驗證miR-279-3p和miR-4448與其靶基因的直接作用。接著在細胞水平驗證CYP325BB1和CYP4H31基因高表達對蚊細胞溴氰菊酯敏感性的影響；并在蚊體內(nèi),運用口飼和基因注射的方法驗證高表達miR-279-3p和miR-4448,對靶基因CYP325BB1和CYP4H31表達水平的調(diào)節(jié),及對淡色庫蚊溴氰菊酯敏感性的影響。 研究結(jié)果顯示miR-279-3p和miR-4448均在敏感品系中高表達,分別為抗性品系的3.3倍(P0.01)和5.5倍(P0.001)；其靶基因CYP325BB1和CYP4H31則在抗性品系高表達,分別為敏感品系的2.3倍(P0.01)和4.97倍(P0.05)；雙熒光報告實驗證實miR-279-3p和miR-4448能直接靶向作用于CYP325BB1和CYP4H31的3'UTR。功能實驗結(jié)果顯示,高表達CYP325BB1和CYP4H31后,蚊細胞對溴氰菊酯的敏感性降低；蚊體內(nèi)高表達miR-279-3p和miR-4448后,其靶基因表達水平降低,且蚊對溴氰菊酯敏感性增加。以上結(jié)果表明,miR-279-3p和miR-4448通過調(diào)控CYP325BB1和CYP4H31的轉(zhuǎn)錄后水平影響蚊對溴氰菊酯的敏感性。 本課題首次報道了miR-279-3p和miR-4448通過調(diào)控其靶基因CYP325BB1和CYP4H31的轉(zhuǎn)錄后水平來參與蚊抗藥性的形成,對深入研究蚊抗藥性機制具有重要的理論意義,為建立更有針對性的蚊抗藥性防治技術(shù)提供新的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：miR-279-3p miR-4448 抗藥性 細胞色素P450 淡色庫蚊 溴氰菊酯
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R384.1
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-14
• 材料與方法14-46
• 1 實驗材料14-16
• 1.1 供試蚊14
• 1.2 細胞系14
• 1.3 主要試劑14-15
• 1.4 主要儀器設(shè)備15-16
• 2 實驗方法16-46
• 2.1 淡色庫蚊RNA和DNA提取與鑒定16-18
• 2.2 miR-279-3p和miR-4448前體pre-miRNA的測定18-22
• 2.3 驗證miR-279-3p和miR-4448及CYP325BB1和CYP4H31表達水平22-27
• 2.4 驗證miR-279-3p和miR-4448及其靶基因CYP325BB1和CYP4H31的直接作用27-34
• 2.5 高表達CYP325BB1和CYP4H31對蚊溴氰菊酯敏感性的影響34-42
• 2.6 高表達miR-279-3p和miR-4448對淡色庫蚊溴氰菊酯敏感性的影響42-46
• 結(jié)果46-71
• 1 淡色庫蚊RNA提取與鑒定46-47
• 1.1 淡色庫蚊RNA電泳鑒定46
• 1.2 淡色庫蚊RNA濃度與純度測定46-47
• 2 miR-279-3p和miR-4448前體pre-miRNA的鑒定47-49
• 2.1 PCR擴增pre-miR-279-3p和pre-miR-4448序列47-48
• 2.2 TA克隆測定pre-miR-279-3p和pre-miR-4448序列48-49
• 3 實時熒光定量PCR驗證miR-279-3p和miR-4448及其靶基因CYP325BB1和CYP4H31表達水平49-51
• 3.1 預(yù)測miR-279-3p和miR-4448的靶基因49-50
• 3.2 實時熒光定量PCR鑒定miR-279-3p和miR-4448在淡色庫蚊敏感和抗性品系中的表達水平50
• 3.3 實時熒光定量PCR鑒定CYP325BB1和CYP4H31在淡色庫蚊敏感和抗性品系中的表達水平50-51
• 4 雙熒光報告系統(tǒng)驗證miR-279-3p和mi-4448及其靶基因CYP325BB1和CYP4H31的直接作用51-58
• 4.1 CYP325BB1和CYP4H31部分3'UTR序列擴增51-54
• 4.2 雙熒光報告載體構(gòu)建54-57
• 4.3 雙熒光報告檢測結(jié)果57-58
• 5 細胞水平檢測高表達CYP325BB1和CYP4H31對蚊溴氰菊酯敏感性的影響58-65
• 5.1 PCR擴增CYP325BB1和CYP4H31 ORF序列及其真核表達載體構(gòu)建58-63
• 5.2 蚊細胞轉(zhuǎn)染PIB-CYP325BB1和PIB-CYP4H31的效率驗證63-64
• 5.3 高表達CYP325BB1和CYP4H31對蚊細胞溴氰菊酯敏感性的影響64-65
• 6 口飼和基因注射microRNA mimic分析高表達miR-279-3p和miR-4448對淡色庫蚊溴氰菊酯敏感性的影響65-71
• 6.1 實時熒光定量PCR驗證口飼淡色庫蚊microRNA mimic后miR-279-3p和miR-4448及其靶基因CYP325BB1和CYP4H31表達水平的變化65-66
• 6.2 口飼microRNA mimic分析高表達miR-279-3p和miR-4448對淡色庫蚊溴氰菊酯敏感性的影響66-68
• 6.3 實時熒光定量PCR驗證基因注射淡色庫蚊microRNA mimic后靶基因CYP325BB1和CYP4H31表達水平的變化68-69
• 6.4 基因注射microRNA mimic高表達miR-279-3p和miR-4448對淡色庫蚊溴氰菊酯敏感性的影響69-71
• 討論71-75
• 小結(jié)75-76
• 參考文獻76-82
• 綜述82-94
• 參考文獻89-94
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況94-95
• 致謝95

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 郭韜;李廣林;魏強;梁永宏;;植物MicroRNA功能的研究進展[J];西北植物學(xué)報;2011年11期

2 孟軍;譚毅;;西尼羅病毒病流行狀況及應(yīng)對策略[J];應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2013年02期

  本文關(guān)鍵詞：淡色庫蚊miR-279-3p和miR-4448與抗藥性關(guān)系研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：284510