慢性髓細(xì)胞性白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性增生性疾病,目前仍缺乏有效的治療方法,復(fù)發(fā)的根源是白血病微小殘余病變(minimal residue disease, MRD)。利用T細(xì)胞進(jìn)行過繼性免疫治療,是治療病毒感染性疾病和腫瘤的理想方法,但是用于治療的T細(xì)胞的特異性、親和性、分化水平和數(shù)量等限制了其應(yīng)用,如何獲得特異、高效、一定數(shù)量的T細(xì)胞是目前亟待解決的問題。采用T細(xì)胞受體(T cell receptor TCR)基因轉(zhuǎn)染的方法,將特異性高親和力TCR轉(zhuǎn)移到受體的T細(xì)胞中,可以特異性殺傷受體體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。蛋白酶3是與人中性粒細(xì)胞顆粒形成相關(guān)的分化抗原,髓性白血病患者體內(nèi)原始低分化的髓系白血病細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)蛋白酶3,提示蛋白酶3是髓性白血病相關(guān)性抗原。PR1為來自蛋白酶3的HLA-A2限制性的9肽,其序列VLQELNVTV。PR1限制性CTL細(xì)胞可殺傷髓性白血病細(xì)胞,而且其殺傷毒性與白血病細(xì)胞內(nèi)蛋白酶3的表達(dá)量明顯相關(guān),但對正常骨髓細(xì)胞無毒性。本研究的目的是制備可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體,優(yōu)化PR1肽刺激產(chǎn)生的高親和力T細(xì)胞條件,聯(lián)合四聚體技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)篩選PR1特異性高親和力T細(xì)胞,為慢性髓細(xì)胞性白血病的過繼治療清除白血病微小殘余病變奠定基礎(chǔ)。 一、可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體的制備 本室在前期工作中已成功構(gòu)建重鏈pQE31-HLA-A2-BSP和輕鏈pQE31-β2m,二者均可以在M15菌株中大量表達(dá)。將誘導(dǎo)、洗滌包涵體獲得的重鏈、輕鏈蛋白與PR1肽以一定的比例加入折疊緩沖液中進(jìn)行稀釋復(fù)性,形成HLA-A*0201/肽復(fù)合物單體。用HLA-I構(gòu)象特異性的W6/32單抗為一抗,間接ELISA法檢測復(fù)性前后HLA-A*0201/抗原肽單體。然后,將復(fù)性后單體經(jīng)Sephacryl-S300柱層析純化,利用分子篩原理收集HLA-A*0201/肽復(fù)合物單體所在峰。以BirA酶作用于融合在HLA-A*0201蛋白C端BSP中的賴氨酸殘基,使HLA-A*0201/肽復(fù)合物單體生物素化,再次經(jīng)Sephacryl-S300柱層析純化。生物素化的HLA-A*0201/肽復(fù)合物單體與熒光素(phycoerythrin或allophycocyanine)標(biāo)記的鏈霉親和素(含4個生物素化位點(diǎn))按4∶1的比例結(jié)合,形成可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體。本實(shí)驗(yàn)成功地獲得了可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體,為標(biāo)記抗原特異性T細(xì)胞,進(jìn)一步篩選研究CML相關(guān)的PR1特異性T細(xì)胞提供重要工具。 二、體外誘生PR1特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的研究 首先,我們制備加載PR1抗原肽的T2細(xì)胞作為刺激細(xì)胞,體外刺激人外周血淋巴細(xì)胞(PBL),用可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體檢測PR1特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞,結(jié)果表明HLA-A*0201 /PR1四聚體具有PR1肽表位特異性,可以采用流式細(xì)胞分析技術(shù)體外分析或分選PR1特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞。然后,用加載不同濃度PR1肽的T2細(xì)胞刺激HLA-A*0201陽性的正常人外周血淋巴細(xì)胞,進(jìn)一步優(yōu)化加載抗原量、刺激時間、刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)PR1肽加載濃度為0.5μmol/L和5μmol/L、刺激時間為21天、刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例為1:10時,所獲得的PR1特異性高親和力CTLs比較多。用LDH釋放實(shí)驗(yàn)對誘生PR1特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞的功能進(jìn)行初步驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)體外誘生PBL特異性殺傷加載PR1肽T2靶細(xì)胞的能力明顯增強(qiáng),表明體外誘生的PR1特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞具有特異性細(xì)胞毒殺傷能力。本實(shí)驗(yàn)為慢性髓細(xì)胞性白血病過繼性免疫治療奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖 1.3.1 凝膠過濾層析純化Fig1.3.1Gel filtration HPLC profiles of HLA-A*0201reconstitution from recombinant heavy chain and β2m and peA.HLA-A*0201/PR1 單體B. HLA-A*0201-BSP 重鏈蛋白 C. β2m 輕鏈蛋白圖1.3.2凝膠過濾層析純化各峰洗脫液SDS-PAGE 電泳分析66.71 2 3 4 5 6 744.329.020.114.397.2

26性聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)是在不加入 對保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1.3.2凝膠過濾層析純化各峰洗脫液SDS-PAGE 電泳Fig 1.3.2 SDS-PAGE analysis of peak fractions appearifiltration of reconstitution mixture.1.低分子量蛋白質(zhì) Marker2、3.A 峰蛋白 4、5.B 峰蛋白6.β2m 蛋白 7.C 峰蛋白

.3 復(fù)性單體結(jié)構(gòu)檢測W6/32 是一種針對 HLA I 類分子重鏈與 β2m 復(fù)合體構(gòu)象表將單體 HLA-A*0201/PR1 以及游離的未復(fù)性的 HLA 重鏈分 ELISA 分析。結(jié)果顯示 HLA-A*0201/PR1 單體可以與 W6/ HLA-A2 重鏈與 β2m 融合蛋白不但是相連的，而且經(jīng)過復(fù)性了一定程度的恢復(fù)。圖 1.3.3 HLA-A*0201/PR1 單體非變性Fig1.3.3 Native-PAGE of HLA-A*0201/1、2 HLA-A*0201/PR1 單體

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 楊曉梅;包涵體蛋白的復(fù)性技術(shù)[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊;2000年02期

2 王雪,宋長征;蛋白質(zhì)復(fù)性的條件及影響因素[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);2003年06期

3 高永貴,關(guān)怡新,姚善涇;包涵體蛋白的變復(fù)性研究[J];科技通報;2003年01期

4 馮小黎;重組包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2001年04期

5 金姝,王穎,王樹軍,張惠珍,李美星,陳影,葛海良;CTL識別的HLA-A2限制性人卵巢癌相關(guān)抗原OVA66表位的鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2005年02期

6 王洪,周吉軍,王宇明;MHC-表位肽四聚體技術(shù)在病毒性肝炎研究中的應(yīng)用[J];世界華人消化雜志;2004年06期

7 徐文鑫;翁開枝;;免疫細(xì)胞在白血病免疫治療應(yīng)用中的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2006年12期

8 王曉花;可溶性MHC-肽四聚復(fù)合物法及其進(jìn)展[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2005年01期

9 劉英,朱平,胡亞美;免疫球蛋白重鏈框架區(qū)的抗原九肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞增殖[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年02期

本文編號：2833503