慢性髓細胞性白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是一種起源于造血干細胞的惡性增生性疾病,目前仍缺乏有效的治療方法,復發(fā)的根源是白血病微小殘余病變(minimal residue disease, MRD)。利用T細胞進行過繼性免疫治療,是治療病毒感染性疾病和腫瘤的理想方法,但是用于治療的T細胞的特異性、親和性、分化水平和數(shù)量等限制了其應用,如何獲得特異、高效、一定數(shù)量的T細胞是目前亟待解決的問題。采用T細胞受體(T cell receptor TCR)基因轉染的方法,將特異性高親和力TCR轉移到受體的T細胞中,可以特異性殺傷受體體內的腫瘤細胞。蛋白酶3是與人中性粒細胞顆粒形成相關的分化抗原,髓性白血病患者體內原始低分化的髓系白血病細胞持續(xù)高表達蛋白酶3,提示蛋白酶3是髓性白血病相關性抗原。PR1為來自蛋白酶3的HLA-A2限制性的9肽,其序列VLQELNVTV。PR1限制性CTL細胞可殺傷髓性白血病細胞,而且其殺傷毒性與白血病細胞內蛋白酶3的表達量明顯相關,但對正常骨髓細胞無毒性。本研究的目的是制備可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體,優(yōu)化PR1肽刺激產生的高親和力T細胞條件,聯(lián)合四聚體技術和流式細胞技術篩選PR1特異性高親和力T細胞,為慢性髓細胞性白血病的過繼治療清除白血病微小殘余病變奠定基礎。 一、可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體的制備 本室在前期工作中已成功構建重鏈pQE31-HLA-A2-BSP和輕鏈pQE31-β2m,二者均可以在M15菌株中大量表達。將誘導、洗滌包涵體獲得的重鏈、輕鏈蛋白與PR1肽以一定的比例加入折疊緩沖液中進行稀釋復性,形成HLA-A*0201/肽復合物單體。用HLA-I構象特異性的W6/32單抗為一抗,間接ELISA法檢測復性前后HLA-A*0201/抗原肽單體。然后,將復性后單體經Sephacryl-S300柱層析純化,利用分子篩原理收集HLA-A*0201/肽復合物單體所在峰。以BirA酶作用于融合在HLA-A*0201蛋白C端BSP中的賴氨酸殘基,使HLA-A*0201/肽復合物單體生物素化,再次經Sephacryl-S300柱層析純化。生物素化的HLA-A*0201/肽復合物單體與熒光素(phycoerythrin或allophycocyanine)標記的鏈霉親和素(含4個生物素化位點)按4∶1的比例結合,形成可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體。本實驗成功地獲得了可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體,為標記抗原特異性T細胞,進一步篩選研究CML相關的PR1特異性T細胞提供重要工具。 二、體外誘生PR1特異性細胞毒性T細胞的研究 首先,我們制備加載PR1抗原肽的T2細胞作為刺激細胞,體外刺激人外周血淋巴細胞(PBL),用可溶性HLA-A*0201/PR1四聚體檢測PR1特異性細胞毒性T細胞,結果表明HLA-A*0201 /PR1四聚體具有PR1肽表位特異性,可以采用流式細胞分析技術體外分析或分選PR1特異性細胞毒T細胞。然后,用加載不同濃度PR1肽的T2細胞刺激HLA-A*0201陽性的正常人外周血淋巴細胞,進一步優(yōu)化加載抗原量、刺激時間、刺激細胞與反應細胞比例等。實驗發(fā)現(xiàn)當PR1肽加載濃度為0.5μmol/L和5μmol/L、刺激時間為21天、刺激細胞與反應細胞比例為1:10時,所獲得的PR1特異性高親和力CTLs比較多。用LDH釋放實驗對誘生PR1特異性細胞毒T細胞的功能進行初步驗證,結果發(fā)現(xiàn)經體外誘生PBL特異性殺傷加載PR1肽T2靶細胞的能力明顯增強,表明體外誘生的PR1特異性細胞毒T細胞具有特異性細胞毒殺傷能力。本實驗為慢性髓細胞性白血病過繼性免疫治療奠定了基礎。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖 1.3.1 凝膠過濾層析純化Fig1.3.1Gel filtration HPLC profiles of HLA-A*0201reconstitution from recombinant heavy chain and β2m and peA.HLA-A*0201/PR1 單體B. HLA-A*0201-BSP 重鏈蛋白 C. β2m 輕鏈蛋白圖1.3.2凝膠過濾層析純化各峰洗脫液SDS-PAGE 電泳分析66.71 2 3 4 5 6 744.329.020.114.397.2

26性聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)是在不加入 對保持活性的蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1.3.2凝膠過濾層析純化各峰洗脫液SDS-PAGE 電泳Fig 1.3.2 SDS-PAGE analysis of peak fractions appearifiltration of reconstitution mixture.1.低分子量蛋白質 Marker2、3.A 峰蛋白 4、5.B 峰蛋白6.β2m 蛋白 7.C 峰蛋白

.3 復性單體結構檢測W6/32 是一種針對 HLA I 類分子重鏈與 β2m 復合體構象表將單體 HLA-A*0201/PR1 以及游離的未復性的 HLA 重鏈分 ELISA 分析。結果顯示 HLA-A*0201/PR1 單體可以與 W6/ HLA-A2 重鏈與 β2m 融合蛋白不但是相連的，而且經過復性了一定程度的恢復。圖 1.3.3 HLA-A*0201/PR1 單體非變性Fig1.3.3 Native-PAGE of HLA-A*0201/1、2 HLA-A*0201/PR1 單體

【參考文獻】

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本文編號：2833503