本文關(guān)鍵詞：cAMP受體蛋白CRP對(duì)霍亂弧菌和河弧菌自然感受態(tài)調(diào)控機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在自然條件下,細(xì)菌主動(dòng)攝取外源DNA,通過(guò)同源重組整合入染色體穩(wěn)定遺傳的過(guò)程被稱作自然轉(zhuǎn)化(natural transformation)。自然轉(zhuǎn)化是細(xì)菌中基因水平轉(zhuǎn)移的重要策略之一。通過(guò)自然轉(zhuǎn)化,細(xì)菌能夠獲得新的性狀以適應(yīng)外界不同的環(huán)境。大量的研究表明自然轉(zhuǎn)化現(xiàn)象在弧菌科細(xì)菌中普遍存在,在弧菌的遺傳多樣性和進(jìn)化中具有重要的作用。發(fā)生自然轉(zhuǎn)化的前提條件是細(xì)菌須處于自然感受狀態(tài)(natural competence)。 TfoX(也稱SXY),是霍亂弧菌(V. cholerae)重要的感受態(tài)調(diào)節(jié)子,其編碼基因是VC1153,在幾丁質(zhì)存在時(shí),它可誘導(dǎo)感受態(tài)相關(guān)基因pilQ、pilA、comEA和ComEC的表達(dá),對(duì)外源DNA的攝取和運(yùn)輸發(fā)揮著重要的作用。cAMP受體蛋白CRP (cAMP receptor protein, CRP)是細(xì)菌中重要的全局性調(diào)節(jié)子,對(duì)霍亂弧菌自然感受態(tài)形成也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,能促進(jìn)pilA、comEA和chiA-1的表達(dá),但是具體機(jī)制仍不清楚。在本研究中,我們以霍亂弧菌和河弧菌(V.fluvialis)這兩種重要的致病性弧菌為模式菌,進(jìn)一步探索CRP對(duì)弧菌自然感受態(tài)的調(diào)控作用�；谖墨I(xiàn)中已確定的霍亂弧菌TfoXVC啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控序列,我們通過(guò)軟件Virtual Foot print和Regulatory Sequence Analysis Tools (RSAT)預(yù)測(cè)到其啟動(dòng)子區(qū)存在可能的CRP的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)比較霍亂弧菌野生株和CRP缺失株遺傳背景下mRNA水平、tfoXVC-lacZ啟動(dòng)子報(bào)告基因活性說(shuō)明CRP轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控感受態(tài)調(diào)節(jié)子TfoXVC,通過(guò)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)進(jìn)一步證明cAMP-CRP復(fù)合物直接結(jié)合于tfoXVC啟動(dòng)區(qū)調(diào)控tfoXVC的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞感受態(tài)的形成。自然轉(zhuǎn)化表型實(shí)驗(yàn)表明,霍亂弧菌ACRP、ΔTfoX的轉(zhuǎn)化頻率都較野生株明顯降低;與此相一致,與野生株相比ACRP、Δ1153、 ACRPΔ1153中感受態(tài)相關(guān)基因chiA-1、comEA、pilB、pilM mRNA的表達(dá)水平都呈下調(diào)趨勢(shì)。為進(jìn)一步證明cAMP-CRP復(fù)合物轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)TfoX的保守性,我們?cè)谛掳l(fā)食源性致病菌河弧菌中進(jìn)行了驗(yàn)證。序列比對(duì)表明,河弧菌的TfoXVF與霍亂弧菌的TfoXVC在核苷酸和氨基酸水平的同源性分別為75.21%和80.69%。首先我們利用5'RACE (rapid-amplification of cDNA ends)確定了河弧菌tfoXVF mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site, TSS)位于tfoXVF ORF上游106bp處,據(jù)TSS推測(cè)的啟動(dòng)子-10區(qū)、-35區(qū)和SD序列分別為TATGAT、TCCGGA和GGGA。啟動(dòng)子區(qū)序列分析也表明存在可能的CRP結(jié)合位點(diǎn)。tfoXVF mRNA水平和tfoXVF -lux啟動(dòng)子報(bào)告基因活性檢測(cè)及凝膠遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)同霍亂弧菌一樣,河弧菌中cAMP-CRP復(fù)合體直接結(jié)合于tfoXVF啟動(dòng)區(qū)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步的序列比對(duì)和生物信息分析表明這種調(diào)控機(jī)制在包括創(chuàng)傷弧菌、弗尼斯弧菌、鰻弧菌等在內(nèi)的弧菌屬中是保守的,其TfoX同源基因上游都存在cAMP-CRP復(fù)合體的結(jié)合位點(diǎn)。此外,本研究初步探索了霍亂弧菌VC1152的功能,VC1152與TfoXVC編碼基因VC1153的轉(zhuǎn)錄方向相反,共用染色體上的基因間隔區(qū)序列／啟動(dòng)子,存在CRP的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)構(gòu)域分析表明VC1152含有HD-domain/PDEase-1, HD-domain是一保守的蛋白結(jié)構(gòu)域,存在于具有磷酸水解酶活性的蛋白酶超家族中,這些蛋白可能參與細(xì)菌核酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或其他的功能調(diào)節(jié)等。本研究中我們探索了VC1152參與自然感受態(tài)的可能性和與CRP的調(diào)控關(guān)系。首先,我們利用5' RACE確定了霍亂弧菌VC1152 mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于VC1152 ORF上游8bp處,啟動(dòng)子報(bào)告基因活性分析及VC1152轉(zhuǎn)錄水平分析表明CRP對(duì)VC1152有正向調(diào)節(jié)作用。自然轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中,霍亂弧菌△1152的轉(zhuǎn)化頻率比野生株明顯降低。感受態(tài)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析顯示,△1152中chiA-1、comEA、pilB、pilM mRNA的轉(zhuǎn)錄水平與野生株相比呈下調(diào)趨勢(shì)。我們的結(jié)果初步提示VC1152可能參與霍亂弧菌自然感受態(tài)的形成,具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。
【關(guān)鍵詞】：霍亂弧菌 河弧菌 自然感受態(tài) cAMP受體蛋白(CRP) TfoX
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.3
【目錄】：

• 縮略詞4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-15
• 第一部分 cAMP-CRP復(fù)合體啟動(dòng)子水平調(diào)節(jié)tfoX15-42
• (一) 霍亂弧菌/河弧菌WT和△CRP中TfoX啟動(dòng)子活性分析15-28
• 一. 材料與方法15-23
• 1. 材料15-17
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法17-23
• 二. 結(jié)果23-28
• (二) cAMP-CRP復(fù)合物直接結(jié)合霍亂弧菌/河弧菌tfoX啟動(dòng)子區(qū)28-33
• 1. 材料與方法28-31
• 2. 結(jié)果31-33
• (三) 霍亂弧菌和河弧菌的自然轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)33-42
• 1. 材料與方法33-39
• 2. 結(jié)果39-42
• 第二部分 霍亂弧菌VC1152基因功能探索42-48
• 一. 材料與方法42-43
• 二. 結(jié)果43-48
• 討論48-51
• 小結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 綜述55-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 碩士研究生期間發(fā)表的論文63-64
• 致謝64

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