發(fā)布時間：2020-08-28 00:01

【摘要】：第一章緒論組織工程技術(shù)的發(fā)展并引入至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,為21世紀(jì)移植醫(yī)學(xué)和外科手術(shù)重建醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來了福音。過去的二十年里,組織工程膀胱領(lǐng)域的研究取得了突破性的進(jìn)展。由于平滑肌在膀胱的儲尿和排尿功能中發(fā)揮了重要的作用,而目前仍缺乏理想的膀胱平滑肌種子細(xì)胞。本課題從這一難點出發(fā),旨在為組織工程膀胱研究尋求一種理想的種子細(xì)胞,以促進(jìn)膀胱平滑肌再生、血管化以及膀胱功能的恢復(fù),并對其作用機(jī)制做了相關(guān)研究。第二章平滑肌祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定我們采用密度梯度離心法分離兔外周血單個核細(xì)胞,采用EGM-2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),在PDGF-BB和TGF-β1的誘導(dǎo)下培養(yǎng)出平滑肌祖細(xì)胞。還通過酶消化法分離培養(yǎng)了兔膀胱平滑肌細(xì)胞。以分化成熟的膀胱平滑肌細(xì)胞作為陽性對照,通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光和real-time PCR技術(shù)對SPC進(jìn)行鑒定,同時還將培養(yǎng)的SPC進(jìn)行單細(xì)胞成克隆分析,觀察其自我更新潛能。并采用卡巴膽堿藥物刺激,觀察SPC的收縮活性。結(jié)果表明,我們成功地分離和培養(yǎng)出了 SPC和RBSMC,分離出的SPC可表達(dá)平滑肌細(xì)胞特征性的基因和蛋白標(biāo)記如SMA、Desmin、Calponin、SM22和SMMHC等,還表達(dá)干/祖細(xì)胞的標(biāo)記KDR、CD133、CD29和CD90。同時還具有祖細(xì)胞的特征,增殖能力強(qiáng)。將分離出的SPC還可在卡巴膽堿刺激下產(chǎn)生收縮反應(yīng),進(jìn)一步證明其具有平滑肌的特性。通過以上研究結(jié)果表明,我們所培養(yǎng)的SPC具有很高的增殖潛能,純度高,具有平滑肌特征,可作為組織工程膀胱的種子細(xì)胞。第三章平滑肌祖細(xì)胞促進(jìn)膀胱平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和刮傷愈合我們采用第二章的方法分離和培養(yǎng)出兔外周血SPC和兔BSMC,將SPC和RBSMC進(jìn)行饑餓培養(yǎng),收集饑餓培養(yǎng)后的細(xì)胞上清液,在其中加入PDGF-BB和TGF-β1的中和抗體,進(jìn)行RBSMC的增殖、遷移和刮傷愈合實驗,觀察SPC對RBSMC的作用。此外,還通過ELISA和real-time PCR檢測SPC上清液中PDGF-BB的含量以及SPC中PDGF-B基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),SPC上清液可以顯著地促進(jìn)RBSMC的增殖、遷移和刮傷愈合能力(P0.05)。加入anti-PDGF-BB中和后,可以明顯地降低SPC促進(jìn)RBSMC增殖和遷移的作用,但是加入anti-TGF-β1中和后,對RBSMC的遷移無明顯影響。通過檢測發(fā)現(xiàn),SPC分泌PDGF-BB的量明顯高于RBSMC(P0.05),SPC的PDGF-B基因表達(dá)也明顯高于RBSMC(P0.05)。本研究表明,SPC可以分泌PDGF-BB,通過旁分泌機(jī)制促進(jìn)RBSMC的增殖、遷移和刮傷愈合。這一結(jié)果為SPC作為種子細(xì)胞在組織工程中的應(yīng)用提供了更多的依據(jù)。第四章平滑肌祖細(xì)胞體外熒光標(biāo)記及細(xì)胞-支架材料復(fù)合物的體外構(gòu)建我們采用第二章的方法分離和培養(yǎng)出兔外周血SPC,采用熒光染料CM-DiI進(jìn)行標(biāo)記,通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記效果和傳代后的細(xì)胞標(biāo)記率。同時,進(jìn)行細(xì)胞爬片培養(yǎng)后免疫熒光染色,觀察標(biāo)記后細(xì)胞表達(dá)平滑肌特征標(biāo)記的情況。進(jìn)行臺盼藍(lán)排斥實驗、細(xì)胞粘附實驗、細(xì)胞增殖實驗和細(xì)胞遷移實驗,觀察標(biāo)記后的SPC的存活率以及粘附、增殖和遷移能力的變化。此外,我們還將標(biāo)記后的細(xì)胞種植到支架材料豬BAM上,構(gòu)建細(xì)胞-支架材料復(fù)合物,通過組織學(xué)染色觀察細(xì)胞的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)4天左右可見SPC開始生長,一周后出現(xiàn)SPC克隆。通過免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析,CM-DiI標(biāo)記率為96%左右,連續(xù)傳代2周后標(biāo)記率仍在40%以上。標(biāo)記后的細(xì)胞可表達(dá)α-SMA、Calponin、PCNA。同時可發(fā)現(xiàn),標(biāo)記后的細(xì)胞存活率無明顯降低,細(xì)胞粘附能力、增殖能力和遷移能力無明顯改變。將細(xì)胞種植到BAM上,通過組織學(xué)染色可發(fā)現(xiàn),SPC可快速長入BAM中。此外,PDGF-BB可以促進(jìn)SPC在BAM中的生長,呈劑量依賴性。本研究證明采用CM-DiI標(biāo)記SPC操作簡便,效果好,不改變細(xì)胞表型,不影響細(xì)胞的存活率和粘附、增殖及遷移能力,可作為SPC的熒光示蹤劑。標(biāo)記后的SPC可快速長入BAM中,PDGF-BB對于SPC在BAM中的生長具有促進(jìn)作用,并呈劑量依賴效應(yīng)。第五章 平滑肌祖細(xì)胞促進(jìn)組織工程膀胱平滑肌再生和功能恢復(fù)采用前期研究中制備的一種保留了生物活性因子并具有較高的孔隙率、合適孔徑的豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)作為支架材料,以分離培養(yǎng)的兔外周血SPC作為種子細(xì)胞,以兔為實驗動物,進(jìn)行膀胱替代,觀察SPC促進(jìn)組織工程膀胱再生和功能恢復(fù)的作用。單純應(yīng)用未接種細(xì)胞的BAM進(jìn)行兔膀胱替代作為對照組。研究結(jié)果顯示,術(shù)后1月時兩組替代區(qū)域的邊緣區(qū)和中心區(qū)的尿路上皮細(xì)胞均已再生良好。在術(shù)后各時間點,實驗組中替代平滑肌束密度、微血管密度和數(shù)目以及神經(jīng)束的再生均明顯高于對照組(P0.05),但兩組中的替代中心區(qū)神經(jīng)束的再生無明顯差異。實驗組的膀胱功能恢復(fù)明顯優(yōu)于對照組(P0.05)。同時,SPC還直接參與構(gòu)成了再生膀胱的平滑肌組織。通過以上研究結(jié)果表明,采用SPC作為種子細(xì)胞進(jìn)行膀胱替代重建,可以顯著地促進(jìn)組織工程膀胱平滑肌再生、血管化和神經(jīng)再生,并促進(jìn)膀胱功能的恢復(fù)。全文結(jié)論本研究中,我們成功地分離培養(yǎng)了兔外周血SPC,并從細(xì)胞水平、蛋白水平和基因水平進(jìn)行全面地鑒定。所培養(yǎng)的細(xì)胞可滿足組織工程膀胱研究的需要。我們通過研究發(fā)現(xiàn),SPC可以分泌生物活性因子PDGF-BB,從而促進(jìn)膀胱平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和刮傷愈合。我們采用CM-DiI作為熒光示蹤劑進(jìn)行SPC的體外標(biāo)記,這種方法切實可行,且操作簡便。經(jīng)CM-DiI標(biāo)記后的SPC可以在支架材料BAM中生長,經(jīng)體外研究證實所培養(yǎng)的SPC-BAM復(fù)合物可以用于膀胱替代研究。我們研究發(fā)現(xiàn),采用SPC作為平滑肌種子細(xì)胞,構(gòu)建SPC-BAM復(fù)合物進(jìn)行膀胱替代,可以促進(jìn)組織工程膀胱平滑肌再生、血管化和神經(jīng)再生,并促進(jìn)膀胱功能的恢復(fù)。研究還發(fā)現(xiàn),SPC可以直接參與平滑肌的再生,同時還通過旁分泌作用促進(jìn)組織工程膀胱再生。通過本課題的研究,進(jìn)一步明確了種子細(xì)胞在組織工程膀胱中的作用,為組織工程膀胱的實驗研究和臨床應(yīng)用積累了一些經(jīng)驗。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 宋起濱;劉曉燕;曹惠鵑;于冬梅;黃昕昕;;CM-DiI標(biāo)記大鼠脂肪干細(xì)胞的效力[J];中國組織工程研究;2012年23期

2 楊斌;孫則禹;蘭厚金;朱偉東;戴玉田;;從膀胱癌患者分離并培養(yǎng)人膀胱平滑肌細(xì)胞[J];臨床泌尿外科雜志;2010年04期

3 楊斌;陳

本文編號：2806794