【摘要】： 造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC)移植的難點是HLA全相合移植供源嚴(yán)重缺乏和移植后的移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)。最近免疫抑制性受體的研究為GVHD防治提供了新的思路。殺傷細(xì)胞(包括NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞)是參與GVHD發(fā)生的重要效應(yīng)細(xì)胞，而其細(xì)胞內(nèi)的殺傷細(xì)胞抑制性受體(Killer cell inhibitory receptors,KIR)是調(diào)節(jié)其免疫殺傷活性的關(guān)鍵分子。P58分子是KIR家族成員，包括P58.1和P58.2，依據(jù)其結(jié)構(gòu)特點可分為2DL1、2DL2、2DL3和2DL4。P58分子的特異性配體是靶細(xì)胞膜上的人類白細(xì)胞抗原C(humanleukocyte antigen C,HLA-C)，二者的結(jié)合具有嚴(yán)格的特異性，結(jié)合后可向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)抑制性信號，抑制其對靶細(xì)胞的殺傷作用。 國外已比較系統(tǒng)的對該信號傳導(dǎo)系統(tǒng)進行了研究。至今，國內(nèi)未見P58基因結(jié)構(gòu)與功能的研究報道，我們對廣東人群P58分子結(jié)構(gòu)特點及HLA-C識別特異性進行了分析研究，并初步探討了該信號系統(tǒng)與GVHD狀態(tài)的關(guān)系。 1、SSP基因分型法和特異引物PCR方法分析了117例廣東人P58、HLA-C基因的分布類型及基因頻率。流式細(xì)胞儀分析法分析了P58基因在免疫細(xì)胞亞群中的表達分布及P58~+細(xì)胞比率。HLA-C基因分布以P58.2結(jié)合型(HLA-Cw1、3、7)為主，基因分布頻率分別為：0.37、0.23和0.43。P58.1結(jié)合型(HLA-Cw2、4、5、6)基因頻率低于0.05。HLA-C基因分布頻率依次為：HLA-Cw7＞HLA-Cwl＞HLA-Cw3＞HLA-Cw4＞HLA-Cw2＞HLA-Cw5。未能檢出HLA-Cw5、9、10基因。結(jié)果表明，該人群HLA-C基因分布主要為P58.2結(jié)合型，與國外報道的泰國人群及高加索人群比較有明顯差異，為該人群特有。 P58的2DL1，2DL2，2DL3，2DL4基因在廣東人群中均有分布，基因頻率分別為：0.69、0.41、0.56和0.86．其中2DL4的分布頻率最高，幾乎分布于所有廣東人，在98％的受檢者中檢測到該基因的存在，基因頻率為0.86。其次為2DL1，而2DL2的基因分布頻率最低。 第一軍醫(yī)大學(xué)搏士學(xué)位論文 結(jié)果證明，廣東漢族人群中P58分子的4個亞型分布頻率與泰國人群及高加索 人群比較有顯著群體差異性；HLA（基因分布為P58．2結(jié)合型，主要為HLA－CWI、 cW3和CW7，分布頻率與國內(nèi)外報道有差異性，為該人群特有。ZDLZ及特異性配 體基因頻率同時高于其它人群，表明是優(yōu)勢遺傳和同步進化的結(jié)果。 2、用流式細(xì)胞儀分析分析了P58分子在兔疫細(xì)胞亞群中的表達分布。P58表達 于 NK、CD3”、CDS”和 CD4”細(xì)胞，其中 NK細(xì)胞中的表達LL率最高（P58．l為 480， P58．2為64％），其次為CDS”（P58．l為12O，P58．2為20o）、而CD4”細(xì)胞低于7o。 P58＊和P58．2在各細(xì)胞亞群中的表達分布變化模式一致，P58．2“細(xì)胞的比率高于 P58．l”細(xì)胞（Prt．of卜結(jié)果表明，廣東漢族人群P58分子在NK、CD3、CD4、CDS 亞群細(xì)胞表達，且主要集中于NK和CDS細(xì)胞亞群，CD4亞群細(xì)胞中的表達比率較 d＼。 3、特異引物PCR法擴增、自動測序和生物學(xué)軟件分析了P58識別HLA－C的 分子基礎(chǔ)。P58分子特異識別和結(jié)合HLA－C區(qū)域，即DI、DZ區(qū)的氨基酸序列與國 外報道序列比較具有一致性和差異性，一致性表現(xiàn)在特異識別HLA（的第44位 氨基酸為賴氨酸或精氨酸，個別序列為天冬酚胺，與國外報道基本一致。差異性主 要在P58表達肽的多變區(qū)，即第40～80位氨基酸序列，突變有2～3種。ZDLI的 氨基酸突變點主要位于 44（M—N工 49（L－T入 52（A－QL 68（R－P＼ 70（T 一M）、77（N—S）、80（N—K）位。ZDLZ的氨基酸突變點主要位于 47（L—P）、 48（I—L）、57（V—S）、67（M—K）、69（F—T－M）、73（G～A）、78（Y～P）、 164（P—V）位。ZDL3的氨基酸突變點主要位于 47（I—A）、48（P—H）、57（V 一A）、67（M—K）、69（Q—Y）、73（G—P）、78（T—Y）、164（A—B）位。 4、SSSS MODEL 自動模擬系統(tǒng)模建、SPDV軟件顯示、分析，人工觀察、 對比、分析了P58分子的原子結(jié)構(gòu)圖、電勢能、分子表面形態(tài)差異。第44位氨基 酸不同的P58分子的分子構(gòu)型、表面形狀和電勢能結(jié)構(gòu)圖有明顯差異；第44位氨 基酸相同，而HLA－C結(jié)合區(qū)其它氨基酸不同的P58分子的基本分子構(gòu)型具有相似 5 第一軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 性，但分子表面形狀和電勢能有一定差異。HLA（特異結(jié)合區(qū)的個別氨基酸突變可 明顯引起分子構(gòu)型、表面形狀和電勢能等變化，影響P58－HLA（結(jié)合面上氫鍵、 鹽橋形成，因而影響P58與HLA（結(jié)合的親和力及穩(wěn)定性。廣東漢族人群中P58 分子的配體識別位點及結(jié)合區(qū)的氨基酸序列、三維空間結(jié)構(gòu)有多態(tài)性。P58分子的 配體識別位點（第44位氨基酸）的氨基酸差異明顯影響三維空間構(gòu)象（包括分子 結(jié)構(gòu)、電勢能、分子表面形態(tài)等人 配體結(jié)合區(qū)任何氨基酸突變均對三維空間結(jié)構(gòu) 有一定影響，這是P58分子的人群、個體多態(tài)性的基礎(chǔ)。結(jié)果顯示廣東漢族人群中
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R392.1
【圖文】：

在紫外光觀察下在19000一2000obP間顯示明顯一條帶，結(jié)果與預(yù)計一致。0D260/280比值在1.8左右，DNA濃度測定在5一16ug/ul之間，用DNA分離試劑盒提供的HZO稀釋2一sug/ul濃度。DNA鑒定結(jié)果符合實驗要求，電泳結(jié)果見圖1。對提取的總RNA進行電泳觀察和OD比值、濃度測定，結(jié)果與預(yù)計一致，鑒定結(jié)果符合實驗要求。RNA在電泳膠中顯示28、18和5S三條帶，表明RNA完整性好，沒有發(fā)生明顯降解，結(jié)果見圖2。，oD26o/280比值在2.0左右，核酸濃度在1一10u留ul之間，用RNA分離試劑盒提供的HZo稀釋lu歲ul濃度。圖1純化基因組DNA電泳鑒定圖圖2純化總RNA電泳鑒定圖(顯示285，185

對提取的總RNA進行電泳觀察和OD比值、濃度測定，結(jié)果與預(yù)計一致，鑒定結(jié)果符合實驗要求。RNA在電泳膠中顯示28、18和5S三條帶，表明RNA完整性好，沒有發(fā)生明顯降解，結(jié)果見圖2。，oD26o/280比值在2.0左右，核酸濃度在1一10u留ul之間，用RNA分離試劑盒提供的HZo稀釋lu歲ul濃度。圖1純化基因組DNA電泳鑒定圖圖2純化總RNA電泳鑒定圖(顯示285，185，55)2HLA一C基因分布頻率本研究廣東人群中HLA一C的基因檢出率及基因頻率見表2。HLA一C的基因分布類型主要為P58.2特異結(jié)合型，即HLA一Cwz、Cw3、Cw7、Cws，其中HLA一Cw7的分布頻率最高

2DL1PCR產(chǎn)物電泳鑒定圖

【共引文獻】

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本文編號：2801092