【摘要】： 造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC)移植的難點(diǎn)是HLA全相合移植供源嚴(yán)重缺乏和移植后的移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)。最近免疫抑制性受體的研究為GVHD防治提供了新的思路。殺傷細(xì)胞(包括NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞)是參與GVHD發(fā)生的重要效應(yīng)細(xì)胞，而其細(xì)胞內(nèi)的殺傷細(xì)胞抑制性受體(Killer cell inhibitory receptors,KIR)是調(diào)節(jié)其免疫殺傷活性的關(guān)鍵分子。P58分子是KIR家族成員，包括P58.1和P58.2，依據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為2DL1、2DL2、2DL3和2DL4。P58分子的特異性配體是靶細(xì)胞膜上的人類白細(xì)胞抗原C(humanleukocyte antigen C,HLA-C)，二者的結(jié)合具有嚴(yán)格的特異性，結(jié)合后可向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)抑制性信號(hào)，抑制其對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。 國(guó)外已比較系統(tǒng)的對(duì)該信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行了研究。至今，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)P58基因結(jié)構(gòu)與功能的研究報(bào)道，我們對(duì)廣東人群P58分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及HLA-C識(shí)別特異性進(jìn)行了分析研究，并初步探討了該信號(hào)系統(tǒng)與GVHD狀態(tài)的關(guān)系。 1、SSP基因分型法和特異引物PCR方法分析了117例廣東人P58、HLA-C基因的分布類型及基因頻率。流式細(xì)胞儀分析法分析了P58基因在免疫細(xì)胞亞群中的表達(dá)分布及P58~+細(xì)胞比率。HLA-C基因分布以P58.2結(jié)合型(HLA-Cw1、3、7)為主，基因分布頻率分別為：0.37、0.23和0.43。P58.1結(jié)合型(HLA-Cw2、4、5、6)基因頻率低于0.05。HLA-C基因分布頻率依次為：HLA-Cw7＞HLA-Cwl＞HLA-Cw3＞HLA-Cw4＞HLA-Cw2＞HLA-Cw5。未能檢出HLA-Cw5、9、10基因。結(jié)果表明，該人群HLA-C基因分布主要為P58.2結(jié)合型，與國(guó)外報(bào)道的泰國(guó)人群及高加索人群比較有明顯差異，為該人群特有。 P58的2DL1，2DL2，2DL3，2DL4基因在廣東人群中均有分布，基因頻率分別為：0.69、0.41、0.56和0.86．其中2DL4的分布頻率最高，幾乎分布于所有廣東人，在98％的受檢者中檢測(cè)到該基因的存在，基因頻率為0.86。其次為2DL1，而2DL2的基因分布頻率最低。 第一軍醫(yī)大學(xué)搏士學(xué)位論文 結(jié)果證明，廣東漢族人群中P58分子的4個(gè)亞型分布頻率與泰國(guó)人群及高加索 人群比較有顯著群體差異性；HLA（基因分布為P58．2結(jié)合型，主要為HLA－CWI、 cW3和CW7，分布頻率與國(guó)內(nèi)外報(bào)道有差異性，為該人群特有。ZDLZ及特異性配 體基因頻率同時(shí)高于其它人群，表明是優(yōu)勢(shì)遺傳和同步進(jìn)化的結(jié)果。 2、用流式細(xì)胞儀分析分析了P58分子在兔疫細(xì)胞亞群中的表達(dá)分布。P58表達(dá) 于 NK、CD3”、CDS”和 CD4”細(xì)胞，其中 NK細(xì)胞中的表達(dá)LL率最高（P58．l為 480， P58．2為64％），其次為CDS”（P58．l為12O，P58．2為20o）、而CD4”細(xì)胞低于7o。 P58＊和P58．2在各細(xì)胞亞群中的表達(dá)分布變化模式一致，P58．2“細(xì)胞的比率高于 P58．l”細(xì)胞（Prt．of卜結(jié)果表明，廣東漢族人群P58分子在NK、CD3、CD4、CDS 亞群細(xì)胞表達(dá)，且主要集中于NK和CDS細(xì)胞亞群，CD4亞群細(xì)胞中的表達(dá)比率較 d＼。 3、特異引物PCR法擴(kuò)增、自動(dòng)測(cè)序和生物學(xué)軟件分析了P58識(shí)別HLA－C的 分子基礎(chǔ)。P58分子特異識(shí)別和結(jié)合HLA－C區(qū)域，即DI、DZ區(qū)的氨基酸序列與國(guó) 外報(bào)道序列比較具有一致性和差異性，一致性表現(xiàn)在特異識(shí)別HLA（的第44位 氨基酸為賴氨酸或精氨酸，個(gè)別序列為天冬酚胺，與國(guó)外報(bào)道基本一致。差異性主 要在P58表達(dá)肽的多變區(qū)，即第40～80位氨基酸序列，突變有2～3種。ZDLI的 氨基酸突變點(diǎn)主要位于 44（M—N工 49（L－T入 52（A－QL 68（R－P＼ 70（T 一M）、77（N—S）、80（N—K）位。ZDLZ的氨基酸突變點(diǎn)主要位于 47（L—P）、 48（I—L）、57（V—S）、67（M—K）、69（F—T－M）、73（G～A）、78（Y～P）、 164（P—V）位。ZDL3的氨基酸突變點(diǎn)主要位于 47（I—A）、48（P—H）、57（V 一A）、67（M—K）、69（Q—Y）、73（G—P）、78（T—Y）、164（A—B）位。 4、SSSS MODEL 自動(dòng)模擬系統(tǒng)模建、SPDV軟件顯示、分析，人工觀察、 對(duì)比、分析了P58分子的原子結(jié)構(gòu)圖、電勢(shì)能、分子表面形態(tài)差異。第44位氨基 酸不同的P58分子的分子構(gòu)型、表面形狀和電勢(shì)能結(jié)構(gòu)圖有明顯差異；第44位氨 基酸相同，而HLA－C結(jié)合區(qū)其它氨基酸不同的P58分子的基本分子構(gòu)型具有相似 5 第一軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 性，但分子表面形狀和電勢(shì)能有一定差異。HLA（特異結(jié)合區(qū)的個(gè)別氨基酸突變可 明顯引起分子構(gòu)型、表面形狀和電勢(shì)能等變化，影響P58－HLA（結(jié)合面上氫鍵、 鹽橋形成，因而影響P58與HLA（結(jié)合的親和力及穩(wěn)定性。廣東漢族人群中P58 分子的配體識(shí)別位點(diǎn)及結(jié)合區(qū)的氨基酸序列、三維空間結(jié)構(gòu)有多態(tài)性。P58分子的 配體識(shí)別位點(diǎn)（第44位氨基酸）的氨基酸差異明顯影響三維空間構(gòu)象（包括分子 結(jié)構(gòu)、電勢(shì)能、分子表面形態(tài)等人 配體結(jié)合區(qū)任何氨基酸突變均對(duì)三維空間結(jié)構(gòu) 有一定影響，這是P58分子的人群、個(gè)體多態(tài)性的基礎(chǔ)。結(jié)果顯示廣東漢族人群中
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R392.1
【圖文】：

在紫外光觀察下在19000一2000obP間顯示明顯一條帶，結(jié)果與預(yù)計(jì)一致。0D260/280比值在1.8左右，DNA濃度測(cè)定在5一16ug/ul之間，用DNA分離試劑盒提供的HZO稀釋2一sug/ul濃度。DNA鑒定結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)提取的總RNA進(jìn)行電泳觀察和OD比值、濃度測(cè)定，結(jié)果與預(yù)計(jì)一致，鑒定結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。RNA在電泳膠中顯示28、18和5S三條帶，表明RNA完整性好，沒(méi)有發(fā)生明顯降解，結(jié)果見(jiàn)圖2。，oD26o/280比值在2.0左右，核酸濃度在1一10u留ul之間，用RNA分離試劑盒提供的HZo稀釋lu歲ul濃度。圖1純化基因組DNA電泳鑒定圖圖2純化總RNA電泳鑒定圖(顯示285，185

對(duì)提取的總RNA進(jìn)行電泳觀察和OD比值、濃度測(cè)定，結(jié)果與預(yù)計(jì)一致，鑒定結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。RNA在電泳膠中顯示28、18和5S三條帶，表明RNA完整性好，沒(méi)有發(fā)生明顯降解，結(jié)果見(jiàn)圖2。，oD26o/280比值在2.0左右，核酸濃度在1一10u留ul之間，用RNA分離試劑盒提供的HZo稀釋lu歲ul濃度。圖1純化基因組DNA電泳鑒定圖圖2純化總RNA電泳鑒定圖(顯示285，185，55)2HLA一C基因分布頻率本研究廣東人群中HLA一C的基因檢出率及基因頻率見(jiàn)表2。HLA一C的基因分布類型主要為P58.2特異結(jié)合型，即HLA一Cwz、Cw3、Cw7、Cws，其中HLA一Cw7的分布頻率最高

2DL1PCR產(chǎn)物電泳鑒定圖

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王曉儉;兩種不同制備酶標(biāo)記結(jié)合物方法的比較[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年01期

2 虞偉,廖建輝,葛存旺,顧寧,武建國(guó);膠體金納米粒子及其蛋白標(biāo)記物在電場(chǎng)中的泳動(dòng)行為研究[J];微納電子技術(shù);2003年09期

3 劉建,彭東信,劉曉晴,朱朝霞,車(chē)東媛,趙時(shí)宇;雙黃連對(duì)肺炎支原體感染大鼠肺組織中PDGF-BB影響的免疫組織化學(xué)研究[J];浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年01期

4 邊倩茹,王玉珠,張玉梅,王以紅,盧秀云,張晨,周蕾,張燕;HCG滴金免疫測(cè)定法試劑的研制及應(yīng)用[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2000年03期

5 常立峻,李振勇,朱德華;ELISA定量檢測(cè)Ⅳ型膠原方法的建立[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2003年02期

6 王玉金,王玉珠,楊書(shū)豪,楊艷艷,邊倩茹,張玉梅,盧秀云,張燕;膠體金免疫層析法檢測(cè)血清癌胚抗原[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2003年03期

7 李華,俞建昆,洪超,龍潤(rùn)?quán)l(xiāng),翟友剛,徐瓊芳,崔萍芳,丁雪鳳,謝忠平;殘余牛血清蛋白ELISA檢測(cè)方法的建立及其初步應(yīng)用[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2005年02期

8 應(yīng)希堂;姜淑華;李振甲;唐寶軍;;第五代放射免疫分析方法及有關(guān)問(wèn)題探討[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2005年04期

9 王成敏;唐寶軍;李振甲;;C-肽雙標(biāo)記液相IRMA方法的實(shí)驗(yàn)研究[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2006年04期

10 劉麗萍,李雷,張愛(ài)芳,容仕霖,劉杰;運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下血液生化指標(biāo)的變化與細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J];北京體育大學(xué)學(xué)報(bào);2002年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 劉陽(yáng);小鼠睪丸足細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟T淋巴細(xì)胞凋亡及其機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2000年

2 吳建春;青藤堿對(duì)移植物抗宿主病的防治作用及免疫學(xué)機(jī)理研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2000年

3 寇志華;鉤端螺旋體保守性抗原與疫苗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

4 唐玲;銀屑病患者朗格漢斯細(xì)胞異常機(jī)制的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

5 覃林花;趨化因子與共刺激分子聯(lián)合基因治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

6 柯重偉;四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)控制白喉毒素-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子融合基因治療胃癌的基因研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

7 楊傳標(biāo);連黛膠囊治療胃腸腫瘤臨床療效觀察與分子機(jī)理研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2001年

8 劉振華;基于樹(shù)突狀細(xì)胞途徑的多發(fā)性骨髓瘤CTLs誘導(dǎo)及其免疫生物學(xué)特征研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2001年

9 喬傳玲;表達(dá)禽流感病毒HA-NA、HA-NP及NP基因重組禽痘病毒的構(gòu)建及其免疫效力的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2001年

10 李引乾;硒對(duì)山羊妊娠調(diào)節(jié)的細(xì)胞與分子免疫學(xué)機(jī)制[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2001年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 柏林;sVEGF在肝癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值及RF治療術(shù)后變化的實(shí)驗(yàn)研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2000年

2 梁雄;廣西地區(qū)肝癌高發(fā)家族HLA-A2與HCC的相關(guān)性研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2001年

3 袁振剛;多發(fā)性骨髓瘤患者樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的特異性抗瘤活性的體外誘導(dǎo)[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

4 許衛(wèi)東;抗人血小板第4因子單克隆抗體(SZ-95)的研制及其應(yīng)用研究[D];蘇州大學(xué);2001年

5 王萬(wàn)山;FMMU白化豚鼠免疫學(xué)特性及作為感染性疾病模型的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2001年

6 鄭峰;重組人誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在V_79細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)及其對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2001年

7 馬勇江;CD58對(duì)妊娠早期山羊子宮局部細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)及其與EPF關(guān)系的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2001年

8 孫學(xué)強(qiáng);中華絨螯蟹“顫抖病”病原的鑒定及免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

9 賈震虎;實(shí)驗(yàn)性免疫應(yīng)激對(duì)雛雞免疫抑制機(jī)理研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

10 柴棟;銅綠假單胞菌生物被膜感染免疫逃逸與防治[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2002年

本文編號(hào)：2801092