本文關鍵詞：脂肪來源間充質(zhì)干細胞（ADSC）調(diào)控變應性鼻炎模型鼠T細胞免疫狀態(tài)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 變應性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是一種呈全球蔓延的鼻腔過敏性疾病,最新根據(jù)變應性鼻炎評分(Score for Allergic Rhinitic, SFAR)標準其發(fā)病率為31.6%,嚴重困擾著人們生活、學習和工作。變應性鼻炎發(fā)病涉及環(huán)境及遺傳兩個方面,近年提出了Thl/Th2免疫反應平衡障礙學說,即AR的發(fā)病主要是Th2型細胞免疫反應優(yōu)勢,通過介導多種炎癥介質(zhì)及細胞因子的釋放,而導致一系列鼻過敏癥狀。因此,糾正以Th2型免疫反應過度為主而恢復Th1/Th2細胞免疫平衡的治療方式成為重要的策略。 T淋巴細胞來源于骨髓的淋巴樣干細胞,按免疫效應功能可分為輔助性T細胞(Th)、細胞毒性T細胞(Tc/CTL)、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、抑制性T細胞(Ts)等。Thl/Th2免疫反應失衡的調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是目前世界范圍內(nèi)的兩大研究熱點。輔助性T細胞(Th)主要分為：Th1、Th2和Th17。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF,參與細胞免疫及遲發(fā)型超敏反應的發(fā)生。抗原特異性Th2細胞在變應性免疫反應中通過釋放大量的Th2型細胞因子(IL-4、5、6、10、13等)啟動和維持炎癥,其中IL-4和IL-13,它調(diào)節(jié)抗原特異性IgE的同型轉(zhuǎn)換,IL-5可募集和激活嗜酸性粒細胞。Thl和Th2型細胞因子相互拮抗,選擇性抑制Th2反應可能對防止變應性炎癥至關重要。Treg細胞具有調(diào)節(jié)Thl／Th2平衡、抑制T淋巴細胞增殖和促進DC細胞成熟等作用。Treg細胞的免疫缺陷是近年來變應性疾病研究的重大發(fā)現(xiàn)之一,其中包括AR,已有研究表明變應性個體中存在變應原特異性Treg細胞數(shù)量和(或)功能的缺陷,并認為可能是AR免疫失衡的重要原因。 間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)屬于中胚層的一類成纖維樣多能干細胞,在人體骨髓、脂肪、臍帶血等組織中都有其分布,具有自我更新、多向分化和再生修復實質(zhì)組織器官的潛能。此外,因其還具有獨特的低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用使其成為干細胞研究領域的一顆新星。MSC可通過誘導細胞分裂阻滯來抑制T、B和DC細胞的增殖,還可抑制NK細胞的增殖和削弱DC細胞的成熟狀態(tài),以及抗原呈遞。MSC依據(jù)靶器官中炎癥微環(huán)境而實施有益的免疫調(diào)節(jié),而無論是Th1免疫反應偏移還是Th2型免疫反應偏移。在變應性鼻炎及哮喘等Th2型免疫反應優(yōu)勢的變態(tài)反應疾病中,MSC可顯著下調(diào)Th2型免疫反應而恢復Th1/Th2細胞免疫平衡,并可上調(diào)CD4+CD25+Treg細胞的比例。脂肪組織來源的MSC,即ADSC,與其他來源MSC一樣具有獨特的非特異性免疫調(diào)節(jié)作用。脂肪組織相比骨髓更豐富,且更易收獲更多量成體干細胞。 目前,AR治療包括藥物對癥處理及特異性免疫治療,藥物對癥處理僅對發(fā)作期患者起控制病情作用,維持時間短,停藥復發(fā),特異性免疫治療因治療患者群受變應原限制,治療周期長,部分患者依從性差,或半途脫落而導致相當一部分患者放棄脫敏治療。因而探尋新的治療方式勢在必行。初步的研究表明,ADSC對Thl／Th2免疫反應失衡及調(diào)節(jié)性T細胞具有復雜的調(diào)節(jié)作用。選擇ADSC重新調(diào)整AR患者Thl／Th2細胞免疫平衡及Treg細胞治療模式成為一項具有創(chuàng)新性的設計策略。因此,本研究在構(gòu)建變應性鼻炎模型鼠的基礎上探討體外膠原酶消化合并貼壁篩選法分離培養(yǎng)的小鼠ADSC對模型鼠輔助性T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞的調(diào)節(jié)作用及其機制。本研究的開展有可能將為今后AR臨床治療開辟一個嶄新的領域奠定基礎。 研究目的 探討體外分離培養(yǎng)小鼠ADSC,并在構(gòu)建變應性鼻炎模型鼠的基礎上進一步探討ADSC對模型鼠輔助性T細胞、Treg細胞的調(diào)節(jié)作用及其機制。 材料及方法 1實驗材料及動物 胰蛋白酶、DMEM/F12、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗、二甲亞砜(DMSO)、膠原酶Ⅰ型、間充質(zhì)干細胞成脂/成骨/成軟骨誘導分化培養(yǎng)基、Balb/c小鼠、卵清蛋白Ⅴ級、Ⅱ級、CM-Dil、Trizol、RT-PCR試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、DEPC、Mouse IL-4ELISA Kit、Mouse IL-6ELISA Kit、Mouse IL-10ELISA Kit、Mouse IFN-γELISA Kit。 Balb/c小鼠[6-8周,雄性,體質(zhì)量18-25g,由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供(合格證scxk粵2011-0015)。] 2方法 2.1ADSC的分離、培養(yǎng) 取10只清潔級Balb/c小鼠,斷頸處死,完全浸泡于75%酒精中約5分鐘消毒,無菌取腹股溝處及附睪周圍脂肪組織,剔除肉眼可見的小血管及結(jié)締組織,含高濃度青霉素(300U/ml)+鏈霉素(300ng/ml)的PBS沖洗3次。眼科剪盡可能剪碎,加入2倍體積的0.1%的I型膠原酶,37℃水浴鍋中震蕩消化約30min,加入2倍體積的PBS液混勻,100目的篩網(wǎng)過濾,1200×g離心10min,移液器輕輕吸棄油性上清,沉淀用PBS洗滌3次,含10%胎牛血清的DMFM/F12培養(yǎng)基重懸,接種于25ml培養(yǎng)瓶中于37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)。24小時后首次換液,以去除殘余的紅細胞及未貼壁的細胞。以后每2-3天換液一次,細胞長滿80%用胰酶消化傳代培養(yǎng)。 2.2流式檢測ADSC的表面標記 收集第3-5代ADSC約2×106個,1200×g離心4min棄上清。Buffer溶液重懸,吸取100μ1細胞懸液(約3.0×105個細胞)加入Ep管內(nèi)。加入適量抗體,避光孵育30min。每樣品管加入1.5～2ml Buffer溶液,1200×g離心4min棄上清。每樣品管加入300μl Buffer溶液重懸后流式細胞儀檢測。 2.3ADSC或脂、成骨及成軟骨誘導分化 取生長狀態(tài)良好的第3-5代ADSC,待細胞達到100%融合時,吸棄舊培養(yǎng)液。先加入2ml/孔的成脂誘導完全培養(yǎng)基A開始誘導,三天后更換為成脂誘導完全培養(yǎng)基B,24h后,再次更換為成脂誘導完全培養(yǎng)基A,如此進行2個循環(huán)。繼續(xù)培養(yǎng)待胞內(nèi)脂滴已較成熟時,對其進行油紅0染色。 取生長狀態(tài)良好的第3-5代ADSC,待細胞達到70～80%融合時后,吸棄舊培養(yǎng)液,加入2ml／孔的成骨誘導分化完全培養(yǎng)基。每三天換液,直至可觀察到明顯鈣結(jié)節(jié)。鏡下觀察見細胞鈣結(jié)節(jié)變多,分化情況較恒定時,進行茜素紅染色。 取生長狀態(tài)良好的第3-5代ADSC,消化離心棄上清,按7.5×105/m1加入軟骨誘導基礎液重懸細胞,1100×g離心5min;棄上清,按5.0×105/ml加入軟骨誘導完全培養(yǎng)液重懸細胞；吸取500μl細胞懸液(即2.5×105個細胞)至15ml離心管中,1100×g離心5min;離心后不可搖動或吹打細胞團,擰松離心管蓋,置于37℃,5%C02中孵育(24h內(nèi)避免搖動細胞團)。每2～3天半量更換軟骨分化誘導液,并輕彈使其脫離管壁懸浮。繼續(xù)誘導培養(yǎng)待細胞團增大后,送做石蠟切片,進行甲苯胺藍染色。 2.4變應性鼻炎小鼠模型的建立、采用尾靜脈注射ADSC處理模型鼠 2.4.1致敏液和激發(fā)液的配制 OVA致敏液：稱取卵清蛋白V (OVA V)2mg,溶于4ml無菌PBS液中,常溫下震蕩溶解配成500ug/ml的OVA溶液：稱取適量明礬(氫氧化鋁),溶于適量無菌PBS液中,超聲波下完全溶解配成10%的明礬溶液,取4ml明礬溶液加入OVA溶液中并充分混勻,用10N NaOH溶液調(diào)整PH至6.5,室溫靜置孵育60min,1200×g離心5min,吸棄上清,沉淀用無菌PBS液重懸至4ml,渦旋振蕩器充分震蕩搖勻。 OVA激發(fā)液：稱取卵清蛋白Ⅱ(OVA Ⅱ)40mg,溶于lml無菌PBS液中,使用前充分混勻。 2.4.2致敏和激發(fā) Balb/c小鼠,60只,適應性飼養(yǎng)3d后完全隨機分為6組(分組表示為：致敏/激發(fā)/處理),隨機選組分別為實驗組1(OVA/OVA/高劑量ADSC)、實驗組2(OVA/OVA/低劑量ADSC)、實驗組3(OVA/OVA/PBS)、實驗組4(OVA/OVA/0)、對照組1(PBS/PBS/0)和對照組2(0/0/0)。實驗組1-4和對照組1分別于第0、7、14天的相同時間,lml無菌注射器取現(xiàn)配的OVA致敏液和PBS液200ul/只(實驗組1-4即100ug)進行基礎致敏。第15-19d,每天相同時間以現(xiàn)配的OVA激發(fā)液(和PBS液)20ul(每側(cè)鼻孔10ul,共800ug)進行滴鼻激發(fā)。滴鼻結(jié)束后立即觀察雙鼻流涕、撓鼻及噴嚏情況并記錄(將其一次性連續(xù)多次抓鼻視為一次反應)。對照組2不做任何處理。 2.4.3CM-Di1熒光探針標記ADSC 取第3-5代長滿約80%的ADSC, DPBS洗滌細胞,胰酶消化,重懸于DPBS液中并計數(shù),每106個細胞加入500ul的2uM的CM-Dil,37℃孵育5min,4℃孵育15min, PBS洗滌3次,重懸于PBS中調(diào)整細胞密度分別為：高濃度ADSC液：3×107/ml和低濃度ADSC液：1×107/ml。 2.4.4尾靜脈注射ADSC處理模型鼠 對致敏組1、2和3分別于致敏激發(fā)第20-22天,溫鹽水擦拭暴露鼠尾靜脈后,1ml注射器分別抽取0.1ml的高濃度ADSC液(即高劑量ADSC)、低濃度ADSC液(即低劑量ADSC)和PBS液對相應的實驗鼠進行尾靜脈注射。 2.4.5癥狀學分析： 從造模第1天開始觀察動物行為、形態(tài)、體征、攝食、飲水等,并于每次鼻腔激發(fā)后觀察記錄15min內(nèi)鼻清涕、噴嚏及撓鼻次數(shù),采用疊加量化計算總分,總分大于5分視為造模成功。 2.5ELISA法檢測血清中的IL-4、IL-6、IL-10及IFN-Y水平 末次處理48小時后,1ml水合氯醛腹腔麻醉小鼠后摘眼球后立即收集外周血,室溫靜置2h后,1500×g離心10min。移液槍小心吸取上層血清采用小鼠ELISA試劑盒檢測其中IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ水平,并進行統(tǒng)計學檢驗。 2.6熒光定量PCR法檢測脾臟組織中IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ的mRNA水平 末次處理48小時后,1ml水合氯醛腹腔麻醉小鼠后摘眼球取外周血并處死,固定四肢后取脾臟,TRIZOL提取總RNA,取2ugRNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應,熒光定量PCR檢測IL-4、IL-6、IL-10及IFN-Y基因表達情況。依據(jù)方法計算各組CT值,并進行統(tǒng)計學檢驗。 2.7組織學分析 末次處理48小時后處死小鼠,顯微鏡下取鼻腔呼吸區(qū)粘膜,10%的甲醛溶液固定,石蠟包埋,連續(xù)切片(約3um),進行常規(guī)HE染色,光鏡下觀察各組鼻粘膜中炎細胞的浸潤情況。熒光顯微鏡綠色激發(fā)光下觀察CM-Dil標記的ADSC在小鼠鼻粘膜(鼻粘膜白片)的遷移。 2.8統(tǒng)計學分析 應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理,結(jié)果以X±s表示。多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析；Levene方差齊性檢驗,若方差不齊,用基于方差不齊的近似F檢驗Welch法；多重比較采用LSD(方差齊時)或Dunnett'sT3法(方差不齊時)。P0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果 1、小鼠ADSC的分離、培養(yǎng) 接種24小時后,顯微鏡下可見少數(shù)細胞貼壁生長,形態(tài)不均一,呈短梭形、多角形,折光性較差。48小時后貼壁細胞明顯增多,逐漸開始伸展,呈長梭形,有粗大突起,立體感增強�；祀s生長細胞隨換液及傳代次數(shù)增加而明顯減少。 2、ADSC的表面標記鑒定 流式細胞表面標志鑒定可見ADSC陽性表達CD44(31.60%),陰性表達CD106(4.98%)、CD34(10.46%)和CD45(12.43%)。 3、ADSC成脂、成骨及成軟骨分化 成脂誘導培養(yǎng)3d后,顯微鏡下細胞立體感漸增強,繼續(xù)培養(yǎng)細胞內(nèi)小脂滴部分開始融合,約6d左右胞內(nèi)脂滴數(shù)量漸增加,細胞由長梭形漸變?yōu)轭悎A形、多邊形,油紅0染色可見胞內(nèi)大量脂質(zhì)沉淀； 成骨誘導培養(yǎng)誘導后細胞漸呈多角形,約10d后,胞質(zhì)內(nèi)可見大量顆粒,細胞呈集落樣生長,細胞間可見鈣質(zhì)沉積；繼續(xù)培養(yǎng)集落中心的細胞漸融合失去細胞結(jié)構(gòu),形成鈣結(jié)節(jié),經(jīng)茜素紅染色見紅色結(jié)節(jié)； 成軟骨誘導培養(yǎng)后細胞團直徑緩慢增大,表面漸光滑呈膠質(zhì),誘導20天左右后甲苯胺藍染色呈淡藍色。 4、癥狀學評分： 實驗組1-4的40只鼠在鼻腔激發(fā)后的15min內(nèi),前5min小鼠即出現(xiàn)反復雙前爪撓鼻、連續(xù)性噴嚏及多量清涕,后10min噴嚏間隙延長,撓鼻及清涕無明顯變化,評分都大于5分,視為造模成功,其中8只出現(xiàn)陣發(fā)性撓耳、撓頸等癥狀。對照組1的10只鼠在致敏激發(fā)后的15min內(nèi),前5min小鼠均出現(xiàn)反復雙前爪撓鼻,但連續(xù)性噴嚏及清涕不明顯,評分小于或等于5。 實驗組1-4和對照組1、2比較,F=414.912,P=0.000,方差齊(P=0.280)進一步采用LSD法進行多重比較,實驗組1-4的癥狀學評分較對照組1、2均具有顯著差異(分別為P=0.000,P=0.000),對照組1與2間無顯著性差異(P=0.483)。提示實驗組1-4的癥狀學評分具有顯著性差異。 5、ELISA法檢測血清中的IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ的水平 按照ELISA試劑盒說明書操作,實驗組1血清中IL-4和IL-6水平顯著下降(與實驗組4比較,P0.05),IL-10和IFN-γ水平顯著增加(與實驗組4比較,P0.05)；實驗組2血清中IL-6水平顯著下降(與實驗組4比較,P0.05),IL-10水平顯著增加(與實驗組4比較,P0.05),IL-4和IFN-γ的水平無顯著性變化(與實驗組4比較,P0.05),盡管二者分別具有降低和增加的趨勢。這提示全身應用ADSC可影響AR模型鼠Th1、Th2及Treg細胞的分泌,進而調(diào)節(jié)機體Th1/Th2免疫狀態(tài)和Treg細胞,并在一定程度上存在ADSC劑量依賴性。 實驗組4血清中IL-4和IL-6水平顯著升高(與對照組2比較,P0.05),IL-10和IFN-γ水平顯著降低(與實驗組4比較,P0.05)。這提示本研究采用0VA+Alum方案成功構(gòu)建了變應性鼻炎模型鼠,模型鼠存在Th1/Th2免疫失衡和Treg細胞功能缺陷。 6、熒光定量PCR法檢測脾臟組織的IL-4、IL-6、IL-10及IFN-Y mRNA的表達 實驗組1脾臟中IL-4和IL-6的mRNA水平顯著下降(與實驗組4比較,P0.05),IL-10和IFN-γ的mRNA水平顯著升高(與實驗組4比較,P0.05)；實驗組2中IL-6的mRNA水平顯著下降(與實驗組4比較,P0.05),IL-10的mRNA水平顯著升高(與實驗組4比較,P0.05),IL-4和IFN-γ的mRNA水平無顯著性變化(與實驗組4比較,P0.05).這提示全身應用ADSC可從基因水平影響AR模型鼠Th1、Th2及Treg細胞的分泌,進而調(diào)節(jié)機體Th1/Th2免疫狀態(tài)和Treg細胞,并在一定程度上存在ADSC劑量依賴性。 實驗組4中IL-4和IL-6的mRNA水平顯著升高(與對照組2比較,P0.05),IL-10和IFN-γ的mRNA水平顯著降低(與實驗組4比較,P0.05)。這提示本研究采用OVA+Alum方案成功構(gòu)建了變應性鼻炎模型鼠,模型鼠在基因水平存在Th1/Th2免疫失衡和Treg細胞功能缺陷。 7、CM-Dil標記的ADSC在鼻粘膜的遷移 鼻粘膜切片在熒光顯微鏡綠色激發(fā)光下可見CM-Dil標記的ADSC呈紅色熒光,可遷移至小鼠鼻粘膜,主要分布于鼻粘膜上皮層和上皮下層,實驗組1(OVA/OVA/高劑量ADSC)明顯多于實驗組2(OVA/OVA/低劑量ADSC)。 8、鼻粘膜組織學分析 實驗組4：嗜酸性粒細胞主要分布于粘膜固有層,并且基底膜增厚,間質(zhì)水腫；實驗組1、實驗組2粘膜中無明顯嗜酸性粒細胞浸潤,基底膜增厚和間質(zhì)水腫明顯低于實驗組4。 結(jié)論 1、Balb/c小鼠雙側(cè)腹股溝及附睪周圍是脂肪組織良好的取材部位。采用膠原酶消化合并貼壁篩選法可分離獲得ADSC。 2、采用Balb/c小鼠以OVA+明礬可成功構(gòu)建變應性鼻炎動物模型。采用CM-Dil成功標記小鼠ADSC。 3、異體靜脈移植的ADSC可向模型鼠鼻粘膜遷移,并發(fā)揮非特異性免疫調(diào)節(jié)效應,這部分是通過影響多種細胞因子的分泌進而調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫失衡和Treg細胞的功能,且在一定程度上具有劑量依賴性。
【關鍵詞】：變應性鼻炎 脂肪來源間充質(zhì)干細胞 Th1/Th2免疫平衡 調(diào)節(jié)性T細胞
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R765.21
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-26
• 前言26-30
• 第一章 小鼠ADSC的分離、培養(yǎng)及鑒定30-39
• 1 主要試劑與儀器30-31
• 2 實驗動物及方法31-33
• 3 結(jié)果33-36
• 4 結(jié)論36
• 5 討論36-39
• 第二章 AR鼠模型的建立、鑒定及ADSC對模型鼠T細胞免疫狀態(tài)的研究39-62
• 1 主要試劑與儀器39-40
• 2 實驗方法40-47
• 3 結(jié)果47-55
• 4 結(jié)論55
• 5 討論55-62
• 全文總結(jié)62-63
• 參考文獻63-69
• 中英文縮略詞表69-70
• 綜述70-79
• 參考文獻76-79
• 碩士期間成果79-80
• 致謝80-81

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10 王秋月　王琳;空軍總醫(yī)院采用間充質(zhì)干細胞救治小腦萎縮[N];科技日報;2009年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 彭飛;620nm非相干紅光對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的光生物調(diào)節(jié)作用[D];華中科技大學;2011年

2 于美嬌;系統(tǒng)歸巢的間充質(zhì)干細胞在牙周組織修復再生過程中的作用研究[D];山東大學;2011年

3 李東杰;人臍帶間充質(zhì)干細胞促進創(chuàng)面愈合及體外誘導分化為表皮樣細胞的實驗研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2011年

4 鄧可斌;鼻鼽合劑治療風寒型變應性鼻炎的臨床與實驗研究[D];湖北中醫(yī)藥大學;2010年

5 王曉巍;變應性鼻炎對嗅覺的影響及糖皮質(zhì)激素干預作用的實驗研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

6 李寶軍;脂肪間充質(zhì)干細胞體外誘導及復合PLGA體內(nèi)異位成軟骨的實驗研究[D];中南大學;2007年

7 朱雅姝;Flk-1~+間充質(zhì)干細胞對腫瘤細胞增殖的抑制作用及其分子機制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2008年

8 吳桂珠;脂肪間充質(zhì)干細胞治療壓力性尿失禁的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學;2010年

9 黃桂鋒;培土生金法治療脾氣虛變應性鼻炎大鼠的實驗研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2010年

10 李家樂;小青龍湯治療變應性鼻炎的文獻與實驗研究[D];南方醫(yī)科大學;2011年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 沙驥超;兒童變應性鼻炎臨床特點分析及相關問題調(diào)查[D];吉林大學;2011年

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本文編號：277878