【摘要】：背景:在當(dāng)前醫(yī)學(xué)界,細(xì)菌感染性疾病仍然占有全世界的第一位的發(fā)病率,極大地威脅著人們的身體健康安全。目前細(xì)菌感染的表現(xiàn)也呈現(xiàn)著多樣化的形式,不僅僅局限于經(jīng)典意義上的感染和炎癥,而是出現(xiàn)包括器官移值后感染、慢性感染、感染后細(xì)胞惡性改變、感染后冠狀動脈粥樣硬化、HIV等后天性免疫系統(tǒng)抑制性感染、細(xì)菌耐藥性感染、機(jī)會致病菌的感染等等許多表現(xiàn)形式。尤其應(yīng)該指出的是,在當(dāng)前醫(yī)學(xué)治療中普遍存在的抗生素泛濫應(yīng)用的現(xiàn)象,使得盡管抗生素不斷推陳出新,仍然解決不了細(xì)菌的耐藥問題,反而加大了抗菌素的毒副作用。往往是一種新型抗生素臨床試用了一段較短的時間后,就發(fā)現(xiàn)有耐藥菌株的出現(xiàn),給臨床治療感染性疾病帶來了令人頭痛的難題。盡管全世界的很多科學(xué)家們都致力于這個問題的研究,但目前對這種問題還沒有一個較理想的解決辦法。自然抗菌多肽在地球上多種動植物體內(nèi)都廣泛性的存在,從植物的種子到低等無脊椎動物,一直到人類的體內(nèi)都存在著這類結(jié)構(gòu)上具有高度保守性結(jié)構(gòu)的抗菌多肽。人防御素是其中非常重要的一類天然抗菌性多肽。它們是生物體在長期的進(jìn)化過程中演化出來的一類與以往的抗生素不同的高效廣譜抗菌性多肽,而且有成分天然,取之于人可用之于人,不易引起毒副作用和細(xì)菌耐藥等問題的特點。因此是一種新型具有臨床應(yīng)用前景的抗菌性藥物。另外,這類天然防御素的基因表達(dá)調(diào)控也與傳統(tǒng)的抗生素不同,使由單基因進(jìn)行表達(dá)的,因而使得轉(zhuǎn)基因的治療方法就成為可能,目的:1997年發(fā)現(xiàn)的人β防御素2(HBD-2)是首次發(fā)現(xiàn)的可誘生性的人防御素,對細(xì)菌、真菌、病毒和支原體都有具有強(qiáng)效廣譜的殺滅作用。本研究目的是嘗試構(gòu)建HBD-2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并從分子、蛋白、免疫、組織工程模型和動物模型等方面對轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行檢測。方法:利用限制性酶切、低溶點瓊脂糖電泳、核酸分子去磷酸化等分子克隆技術(shù)構(gòu)建并擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBabeNeo-HBD-2,結(jié)合Lipofectin法對多種哺乳動物細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。用ELISA法檢測HBD-2生成情況;提取細(xì)胞的mRNA,并制備p~(32)標(biāo)記探針進(jìn)行Northem Blot雜交,檢測HBD-2的mRNA表達(dá):利用CM Extraction和ZipTip技術(shù)由細(xì)胞培養(yǎng)液提取HBD-2,利用AU膠和Geloverlay技術(shù)檢測生物學(xué)活性;利用Western Blot技術(shù)檢測其免疫學(xué)活性;建立離體組織工程模型和SCID小鼠在體模型檢測其抗菌生物學(xué)活性;并利用ELISA和RT-PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞生物學(xué)功能進(jìn)行檢測。結(jié)果:成功構(gòu)建pBabeNeo-HBD-2載體,并從分子、細(xì)胞、蛋白質(zhì)和免疫學(xué)等多個水平角度證明了HBD-2基因在多種哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功,并可轉(zhuǎn)錄為mRNA,并表達(dá)合成HBD-2分子。而且無論在分子大小,電泳能力,抗菌活性,還是與抗體的特異性結(jié)合方面,都與標(biāo)準(zhǔn)的HBD-2是一致的。在離體和載體模型也顯示其具有抗菌活性。結(jié)論:本研究在世界上首次對哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行HBD-2轉(zhuǎn)基因的嘗試,結(jié)果證明利用新構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體成功地對多種細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染,并且合成的HBD-2分子與標(biāo)準(zhǔn)的提取自人體組織的HDB-2是一致的,給今后對HBD-2的研究利用,以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在器官移植后抗感染增強(qiáng)免疫能力等領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了一條新的途徑,具有非常重要的研究和應(yīng)用意義。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2772346