【摘要】：幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)在全球人口中的感染率超過50%，已被確定為慢性胃炎、消化性潰瘍的重要致病菌，并被世界衛(wèi)生組織列為胃癌的Ⅰ類致癌因子。 表位是抗原分子中決定抗原特異性的關鍵部分，合理組合優(yōu)勢表位，可誘導出比原始抗原更為高效和特異的免疫應答。H. pylori感染導致機體對H. pylori自身天然抗原產(chǎn)生免疫耐受，選擇H. pylori保護性抗原的優(yōu)勢表位來構建表位疫苗，有可能打破免疫耐受，從而達到免疫預防和清除H. pylori感染的目的。前期研究證實，特異性CD4+T細胞應答在抗H. pylori感染的保護性免疫應答中至關重要。本研究通過構建H. pylori Th表位疫苗，采用先免疫后攻毒以及先感染后治療兩種方式，在動物模型上對疫苗的預防和清除的保護效果進行評價，并探討相應的免疫應答機制。主要研究方法、結(jié)果和結(jié)論如下： 1.幽門螺桿菌Th表位的篩選和疫苗的設計 通過生物信息學的方法預測并篩選H. pylori保護性抗原HpaA、CagA和UreB的優(yōu)勢Th表位，共篩選到17個表位肽。動力學模擬考察不同表位連接順序所構成蛋白的動力學和熱力學穩(wěn)定型，確定以HpaA表位-CagA表位-UreB表位的連接順序來構建Th表位疫苗Epivac。 2.幽門螺桿菌Th表位疫苗的構建、表達和純化 構建疫苗蛋白的原核表達質(zhì)粒pET30a-epivac，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)，經(jīng)誘導表達和純化，獲得目的蛋白Epivac，HPLC分析蛋白純度在90%以上。相同的技術方法制備含分子內(nèi)佐劑的疫苗蛋白LTB-epivac。 3.幽門螺桿菌Th表位疫苗的免疫保護效果評價及應答分析 1)幽門螺桿菌Th表位疫苗免疫預防效果的評價及應答分析 采用鼻腔滴注和皮下注射兩種免疫途徑，Epivac聯(lián)用不同佐劑對BALB/c小鼠進行免疫，評價疫苗的免疫預防效果。結(jié)果顯示，單用疫苗以及聯(lián)用佐劑都可以有效預防H. pylori感染，且聯(lián)用佐劑效果更優(yōu)。此外，鼻腔滴注發(fā)揮保護作用的時間點要早于皮下注射。ELISA檢測特異性抗體IgG、IgA的產(chǎn)生；Real-time RT PCR和ELISA檢測脾淋巴細胞和胃組織細胞因子的表達變化；流式細胞術定量檢測抗原特異性CD4+T細胞的水平及其應答特征。結(jié)果提示疫苗的保護作用與抗體應答無關，而主要依賴于疫苗誘導的系統(tǒng)性和局部的Th1型CD4+T細胞應答。 2)幽門螺桿菌Th表位疫苗免疫清除效果的評價及應答分析： 利用BALB/c小鼠模型對表位疫苗的免疫清除效果進行評價。相對于未免疫組，疫苗免疫可以顯著降低小鼠胃內(nèi)H. pylori的定植量，具有一定的治療效果。通過分析小鼠抗體應答的特征，推測疫苗的免疫清除作用可能與特異性Th1型細胞應答密切相關。 4.幽門螺桿菌Th表位疫苗的初步安全性評價 通過內(nèi)毒素檢測、急性毒性試驗和豚鼠最大化試驗對疫苗的安全性進行初步評價，結(jié)果顯示疫苗內(nèi)毒素低于限量，且鼻腔滴注和皮下注射兩種給藥方式不會引起機體損傷和過敏反應，初步說明疫苗是安全無毒的。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【圖文】：

22圖 2-1 表位不同連接順序所構成蛋白的三維結(jié)構模擬。(A) Hepi-Uepi-Cepi的三維模擬結(jié)構 (B)Hepi-Cepi-Uepi的三維模擬結(jié)構(C) Uepi-Hepi-Cepi的三維模擬結(jié)構 (D) Cepi-Uepi-Hepi的三維模擬結(jié)構(E) Cepi-Hepi-Uepi的三維模擬結(jié)構 (F) Uepi-Cepi-Hepi的三維模擬結(jié)構.2.4.2 分子動力學模擬評價表位不同連接順序所構成蛋白的動力學和熱力學子動力學模擬過程中，蛋白的α碳原子的RMSD(Root Mean Square Deriv方根)是衡量蛋白質(zhì)結(jié)構穩(wěn)定性的重要參數(shù)。模擬過程中，RMSD在越短恒定狀態(tài)，且RMSD值越小，一般認為這種結(jié)構的蛋白具有越強的動力2-2是表位不同連接順序所構成的6種蛋白在分子動力學模擬過程中RMS的曲線(圖2-2)。從圖中可以看出，蛋白Hepi-Uepi-Cepi在模擬到500ps的時候，

差異均方根)是衡量蛋白質(zhì)結(jié)構穩(wěn)定性的重要參數(shù)。模擬過程中，RMSD在越短的時間內(nèi)達到恒定狀態(tài)，且RMSD值越小，一般認為這種結(jié)構的蛋白具有越強的動力學穩(wěn)定性，圖2-2是表位不同連接順序所構成的6種蛋白在分子動力學模擬過程中RMSD隨時間變化的曲線(圖2-2)。從圖中可以看出，蛋白Hepi-Uepi-Cepi在模擬到500ps的時候，RMSD

SDS-PAGE 檢測。c 表達形式的鑒定，6000rpm 離心 10min，作時間 5s，間隔時間 5片，上清再經(jīng) 12 000×3.1.3 實驗結(jié)果增察 PCR 結(jié)果(圖 2-1)，在定為 epivac 基因片段。

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9 張文華,吳承遠,王曉民;TH和GDNF雙轉(zhuǎn)基因工程細胞對多巴胺能神經(jīng)元的保護作用[J];臨床神經(jīng)外科雜志;2004年04期

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本文編號：2764040