本文關(guān)鍵詞：沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對HeLa細胞自噬及體內(nèi)感染過程的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv（Salmonella plasmid virulence genes）與細菌毒力表型密切相關(guān)。本實驗以攜帶spv基因的鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium，S.typhimurium）野生株和突變株為受試菌，通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)化條件構(gòu)建熒光素酶標記的發(fā)光菌株。構(gòu)建沙門菌感染的細胞模型和實驗動物模型，研究該基因在體內(nèi)外對細胞自噬及感染過程的影響，為后續(xù)深入研究沙門菌致病機制及探索細胞自噬分子機制提供理論和實驗依據(jù)，并為實時動態(tài)追蹤沙門菌的感染過程提供有效的工具和手段。 方法： 一、鼠傷寒沙門菌生物發(fā)光菌株的構(gòu)建 為研究影響電轉(zhuǎn)化效率的因素，選用不同感受態(tài)細菌培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基、感受態(tài)細胞濃度、電擊參數(shù)和質(zhì)粒濃度等條件，以小分子質(zhì)粒pDMT-GFP電轉(zhuǎn)化受試菌，通過計算轉(zhuǎn)化效率確定優(yōu)化的電轉(zhuǎn)條件。在此基礎(chǔ)上用攜帶熒光素酶基因的大分子質(zhì)粒pBEN276電轉(zhuǎn)化spv基因野生株S. typhimurium χ3306和spv基因突變株S. typhimurium UF110。成功獲得轉(zhuǎn)化子后以阿拉伯糖誘導(dǎo)重組，經(jīng)生物發(fā)光檢測篩選穩(wěn)定發(fā)光菌株，獲得野生株和突變株的發(fā)光菌χ3306lux和UF110lux。連續(xù)傳代12d，每3d檢測一定數(shù)量細菌的生物發(fā)光強度，以確定生物發(fā)光的穩(wěn)定性。梯度稀釋發(fā)光菌菌液，檢測生物發(fā)光強度，計算菌量和發(fā)光強度的關(guān)系。 二、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對HeLa細胞自噬的影響 1.以攜帶spv基因的鼠傷寒沙門菌野生株χ3306lux和突變株UF110lux與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了帶有紅色和綠色熒光蛋白標記微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associatedprotein1light chain3，LC3）（mRFP-GFP-LC3）的HeLa細胞體外共培養(yǎng)，制備細胞感染模型，以未感染的細胞作為正常對照組。細菌培養(yǎng)至對數(shù)期后，以100：1的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）感染細胞。在細菌細胞共培養(yǎng)1h后向培養(yǎng)基中加入終濃度100μg/ml的阿米卡星（Amikacin，AMK）殺滅胞外菌。AMK作用2h后更換培養(yǎng)基，使AMK濃度降至10μg/ml以抑制從感染細胞中釋放至培養(yǎng)基中的細菌生長。分別在共培養(yǎng)后1h、3h和5h收集細胞，用共聚焦激光掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察胞內(nèi)LC3-Ⅱ黃色點狀結(jié)構(gòu)。 2.以野生株χ3306lux和突變株UF110lux感染HeLa細胞，按上述方法制備細胞感染模型。分別在感染后1h、3h和5h收集細胞，用蛋白免疫印跡法（Westernblot，WB）檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和p62蛋白的表達情況，，通過檢測胞內(nèi)菌生物發(fā)光強度追蹤細菌胞內(nèi)繁殖情況，并用平板菌落計數(shù)法檢測胞內(nèi)集落形成單位（colony forming unit，CFU）。 三、spv基因?qū)w內(nèi)感染過程的影響 用野生株χ3306lux和突變株UF110lux腹腔注射感染小鼠，建立體內(nèi)感染模型，以注射等量生理鹽水的小鼠作為正常對照組。（1）感染后6h、1d、2d、3d、4d和5d記錄小鼠的體重變化和存活情況。（2）為檢測細菌生物發(fā)光強度追蹤細菌在不同臟器的定位取小鼠麻醉，用小動物活體成像儀觀察兩組細菌在小鼠體內(nèi)的繁殖和播散。每組隨機抽取小鼠處死并分離肝臟、脾臟和盲腸，觀察臟器形態(tài)學變化并檢測生物發(fā)光強度。（3）隨機抽樣用平板菌落計數(shù)法檢測小鼠肝臟和脾臟的胞內(nèi)CFU，WB檢測肝臟自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和p62的表達。 結(jié)果： 一、生物發(fā)光菌株的構(gòu)建 以含NaCl濃度15g/L的高滲LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌至OD600為0.3，制備濃度為1010cfu/mL的感受態(tài)細胞，在參數(shù)為2.5kV,400,50μF條件下，用常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)化的大質(zhì)粒pBEN276轉(zhuǎn)化受試菌后成功獲得轉(zhuǎn)化子。誘導(dǎo)重組后，經(jīng)PCR鑒定及生物發(fā)光檢測，成功構(gòu)建了穩(wěn)定發(fā)光的鼠傷寒沙門菌菌株χ3306lux和UF110lux。 二、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對HeLa細胞自噬的影響 1. CLSM檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ結(jié)果顯示，細菌和細胞共培養(yǎng)1h后，野生株χ3306lux感染組細胞內(nèi)LC3-Ⅱ的黃色熒光點狀聚集數(shù)量明顯低于突變株UF110lux感染組（p0.05），3h和5h時兩組黃色熒光點狀聚集數(shù)量未見明顯差異（p0.05）。 2. WB檢測結(jié)果顯示，在細菌和細胞共培養(yǎng)1h后，野生株感染組細胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表達低于突變株感染組（p0.05），3h和5h未見明顯差異（p0.05）。在細菌和細胞共培養(yǎng)1h后，野生株感染組細胞自噬底物蛋白p62表達高于突變株感染組（p0.05），3h和5h未見明顯差異（p0.05）。胞內(nèi)菌生物發(fā)光檢測結(jié)果顯示，在細菌和細胞共培養(yǎng)1h后，兩感染組間胞內(nèi)菌生物發(fā)光強度未見明顯差異（p0.05），共培養(yǎng)3h和5h后，野生株感染組胞內(nèi)菌生物發(fā)光強度高于突變株感染組（3h，p0.05；5h，p0.01）。平板菌落計數(shù)結(jié)果顯示，在細菌和細胞共培養(yǎng)1h后，兩感染組間胞內(nèi)活菌數(shù)未見明顯差異（p0.05），共培養(yǎng)3h和5h后，野生株感染組胞內(nèi)活菌數(shù)高于突變株感染組（3h，p0.05；5h，p0.01）。 三、spv基因?qū)w內(nèi)感染過程的影響 1.動物模型結(jié)果顯示，在感染后1-5d，野生株感染組和突變株感染組小鼠均有毛發(fā)凌亂，活動少，精神狀態(tài)差，腹瀉消瘦等現(xiàn)象，以野生株感染組小鼠為重且存活率更低。對照組小鼠毛發(fā)有光澤，活動多，精神狀態(tài)好，體重基本維持不變。 2.小動物活體成像結(jié)果顯示，感染后2d，野生株和突變株感染組體內(nèi)均可檢測到發(fā)光的細菌，同一時間點野生株生物發(fā)光強度高于突變株感染組。隨著感染時間的延長，野生株感染組細菌在小鼠體內(nèi)的繁殖和擴散速度較快，至5d已播散至全身，而突變株感染組繁殖和擴散程度卻較慢。解剖小鼠后觀察肝、脾和盲腸形態(tài)學變化，發(fā)現(xiàn)野生株和突變株感染組與對照組相比，肝臟、脾臟明顯增大，盲腸縮短并出現(xiàn)水泡樣病變；野生株感染組與突變株感染組相比，肝臟和脾臟腫大更嚴重，肝臟表面出現(xiàn)點狀病灶，盲腸縮短更多且水泡樣病變更重，表面充血更重。生物發(fā)光檢測結(jié)果顯示，野生株感染組各臟器內(nèi)細菌發(fā)光強度高于突變株感染組。 3.肝臟和脾臟胞內(nèi)活菌計數(shù)結(jié)果顯示，野生株感染組肝臟和脾臟胞內(nèi)活菌數(shù)均高于突變株感染組（p0.05）。WB檢測結(jié)果顯示，在感染后6h、1d和2d，野生株感染組小鼠肝臟和脾臟中Beclin-1蛋白的表達明顯高于突變株感染組（p0.05），p62蛋白的表達明顯低于突變株感染組（p0.05），3d至5d兩組未見明顯差異（p0.05）。 結(jié)論： 1.以優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化條件成功構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌穩(wěn)定生物發(fā)光菌株，為今后在體內(nèi)外實時動態(tài)追蹤沙門菌感染提供了有效工具。 2.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv能影響HeLa細胞自噬水平，以利于宿主菌在細胞內(nèi)的存活。 3. spv基因可提高宿主菌的致病性，促進其在機體內(nèi)的繁殖和播散，加重感染進程。
【關(guān)鍵詞】：沙門菌 spv 自噬 生物發(fā)光 活體成像
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-13
• 前言13-16
• 第一部分 鼠傷寒沙門菌生物發(fā)光菌株的構(gòu)建16-32
• 1. 材料與方法16-22
• 2. 結(jié)果22-28
• 3. 討論28-32
• 第二部分 沙門菌質(zhì)粒毒力基因 spv 對 HeLa 細胞自噬的影響32-43
• 1. 材料與方法32-35
• 2. 結(jié)果35-40
• 3. 討論40-43
• 第三部分 spv 基因?qū)w內(nèi)感染過程的影響43-53
• 1. 材料與方法43-45
• 2. 結(jié)果45-49
• 3. 討論49-53
• 小結(jié)53-54
• 參考文獻54-59
• 綜述原核生物基因敲除技術(shù)的研究進展59-72
• 參考文獻67-72
• 公開發(fā)表的論文72-73
• 本課題基金資助73-74
• 英文縮略詞表74-75
• 致謝75-77

【參考文獻】

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本文編號：276180