【摘要】：研究目的： Daple又稱為含有高亮氨酸殘基的Dvl相關(guān)蛋白。Daple是Girdin家族的基因(Girdin, Daple, FLJ004354)。其中Daple和Girdin在N端有很大的同源性,(54%的氨基酸相同),意味著兩個(gè)基因功能相似,而C末端則與Girdin較少的相似性,只有27%,這意味著Daple具有不同于Girdin的特殊功能。Daple在Wnt經(jīng)典途徑中抑制β-catenin聚集和T細(xì)胞因子(Tcf)的轉(zhuǎn)錄活性,起負(fù)調(diào)節(jié)作用。而在非經(jīng)典Wnt通路中增加蛋白激酶C(PKC)與Dvl互相作用激活Rac蛋白,起正調(diào)節(jié)作用。目前已知Daple在出生后期細(xì)胞遷移中起著重要的作用,Daple可能會(huì)影響胚胎發(fā)育、血管發(fā)生和腫瘤發(fā)展。目前哺乳動(dòng)物Daple的分布表達(dá)的仍不明確。因此,全面了解Daple蛋白的功能及分布對(duì)于進(jìn)一步了解相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后有重要意義。本研究重點(diǎn)是Daple基因的表達(dá)分布。 材料與方法： 通過(guò)SA剪接受體技術(shù)制作的Daple基因敲除的老鼠購(gòu)自transgenic公司。出生7天的老鼠(p7；雌性)和8周老鼠(p56；雄性)(野生型老鼠(+／+)同源性老鼠(-／-))用4%PFA灌注,解剖出組織、冰凍、冰凍切片,解凍安裝在載玻片上。Daple分布可以通過(guò)Lac Z染色顯示并可以應(yīng)用原位雜交技術(shù)驗(yàn)證LacZ染色的結(jié)果。用33P或地高辛標(biāo)記的Daple cRNA探針(外顯子30)。根據(jù)daple基因在腦中的分布,進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)進(jìn)行免疫組化染色,用PGP9.5, GFAP標(biāo)記,判定daple基因是在神經(jīng)元或是膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。根據(jù)其分布的特點(diǎn)對(duì)腦內(nèi)可能出現(xiàn)的異常酶進(jìn)行PCR和RT-PCR分析。 結(jié)果： 我們發(fā)現(xiàn)Lac Z染色的p7和p56的同源性Daple敲除的小鼠在紋狀體、腦室室管膜細(xì)胞、小腦(大概在皮質(zhì)上的浦肯野細(xì)胞)、海馬、嗅球、脊髓、氣管、膀胱、毛囊、舌、胃、脾、胰腺、心肌細(xì)胞、視網(wǎng)膜、腎乳頭和門(mén)靜脈,beta-geo(Daple啟動(dòng)子介導(dǎo)Lac Z和抗新霉素基因融合)表達(dá)而野生型小鼠不表達(dá)。原位雜交技術(shù)也證實(shí)了這個(gè)結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)在脈絡(luò)叢和海馬CA3區(qū),Daple在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),而在紋狀體中,Daple同時(shí)在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)。酪氨酸羥化酶(TH)RT-PCR和eal time PCR的結(jié)果顯示同源性Daple敲除小鼠和野生型小鼠在酪氨酸羥化酶表達(dá)中并沒(méi)有顯著性差異。 結(jié)論： 我們成功的描述出Daple的基因表達(dá)。Daple在腦、脊髓、眼、膀胱上皮及平滑肌、支氣管上皮、胃、腎臟、睪丸、輸精管、毛囊、舌、門(mén)靜脈表達(dá)顯著。Daple在小鼠腦中的分布主要在紋狀體、海馬、齒狀回、皮質(zhì)、黑質(zhì)和室管膜細(xì)胞上。在脈絡(luò)叢和海馬CA3區(qū),Daple在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),在紋狀體中Daple同時(shí)在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò)酪氨酸羥化酶PCR的結(jié)果顯示同源性Daple敲除小鼠和野生型小鼠在酪氨酸羥化酶表達(dá)中并沒(méi)有顯著性差異,提示同源型敲除小鼠中多巴胺含量與野生型小鼠區(qū)別不大。希望通過(guò)了解Daple在小鼠全身器官、中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布情況,可以更清楚地了解Wnt信號(hào)通路的作用,并為以后的神經(jīng)功能實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2757006