發(fā)布時(shí)間：2020-07-05 05:51

【摘要】：丙型肝炎病毒(HCV)包膜區(qū)E2基因變異較大，病毒侵入機(jī)體時(shí)，可逃避機(jī)體的免疫攻擊，與HCV感染慢性化有關(guān)。包括高變區(qū)的E2蛋白含有中和性抗原表位，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體。因此對(duì)HCV包膜區(qū)基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及相應(yīng)蛋白功能的研究，將有助于尋找HCV具有免疫保護(hù)作用的部位，對(duì)于研制疫苗及治療用藥、理解HCV感染后慢性化的機(jī)理以及HCV與宿主的相互作用均具有重要意義。本文選取HCV包膜區(qū)E2基因作為研究對(duì)象，進(jìn)行了基因克隆、蛋白表達(dá)以及蛋白的免疫原性和模擬表位的研究。 一、HCV包膜蛋白E2基因的克隆與測(cè)序 從一名HCV感染者血清中提取病毒RNA，用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以半巢式PCR擴(kuò)增出E2區(qū)基因，通過(guò)將基因克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒，篩選具有正確讀碼框架的E2區(qū)基因。序列測(cè)定結(jié)果表明我們克隆的基因?yàn)镠CV 1b型包膜蛋白E2基因。 二、HCV包膜蛋白E2的表達(dá)與純化 構(gòu)建了一系列包膜蛋白E2基因的原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒和真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。在大腸桿菌pQE30表達(dá)質(zhì)粒中，表達(dá)了三種E2蛋白：P16、P30和P38。用Ni-NTA螯合親和層析純化了表達(dá)的蛋白，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和蛋白印跡試驗(yàn)(Western Blot，WB)檢測(cè)，純化的蛋白可特異地與HCV感染者血清發(fā)生反應(yīng)。在真核表達(dá)系統(tǒng)中，有部分E2蛋白得到了表達(dá)，大部分未發(fā)現(xiàn)蛋白的表達(dá)。 三、HCV包膜蛋白E2的免疫原性和模擬表位研究 利用純化的包膜蛋白E2(P16)對(duì)HCV感染者進(jìn)行了抗-E2抗體的篩查，陽(yáng)性率為32.1％；利用質(zhì)粒pCIHCVe2進(jìn)行了包膜蛋白E2的基因免疫方面的研究，發(fā)現(xiàn)E2蛋白在誘發(fā)機(jī)體的體液免疫方面具有一定的作用；通過(guò)利用P16結(jié)合血清中的抗-E2抗體篩選了一個(gè)隨機(jī)十二肽庫(kù)，找到了一個(gè)模擬表位，可
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2000
【分類號(hào)】：R373
【圖文】：

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本文編號(hào)：2742185