【摘要】：研究背景 動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，目前認(rèn)為其發(fā)生、發(fā)展可能與自身免疫性炎癥相關(guān)。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupuserythematosus， SLE)是典型的自身免疫性疾病，患者AS相關(guān)性心腦血管疾病的發(fā)生率和死亡率顯著增高。近年來，有不少研究認(rèn)為高遷移率族蛋白（high-mobility group box protein l, HMGB1）、Toll樣受體（toll-likereceptors， TLRs）是促進(jìn)AS及SLE發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子。但有關(guān)HMGB1-TLRs軸在SLE伴發(fā)AS中的具體免疫發(fā)生機(jī)制，尚未明確。 研究目的 本實(shí)驗(yàn)采用ApoE-/-小鼠腹腔注射降植烷，建立紅斑狼瘡伴發(fā)AS模型，分析主動(dòng)脈斑塊HMGB1、TLR4受體及下游主要信號分子表達(dá)差異，并用Toll樣受體4（TLR4）基因特異性RNA干擾（RNAi），進(jìn)一步探討TLR4信號在SLE伴發(fā)AS小鼠模型中的免疫病理機(jī)制，以期為深入AS的自身免疫性炎癥機(jī)制及其潛在治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 方法 1.有效封閉TLR4基因表達(dá)的RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及篩選：用篩選出的TLR4-shRNA，轉(zhuǎn)染小鼠平滑肌細(xì)胞株，熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)強(qiáng)度，實(shí)時(shí)定量PCR檢測各轉(zhuǎn)染細(xì)胞TLR4mRNA表達(dá)水平，篩選出有效阻斷TLR4表達(dá)的小分子干擾RNA載體。 2．動(dòng)物模型建立及實(shí)驗(yàn)方案 apoE-/-小鼠和B6小鼠隨機(jī)分為apoE-/-+降植烷組(AS)、apoE-/-+生理鹽水對照組(A)、B6+降植烷組(S)，B6+生理鹽水組(C),各組小鼠在高脂喂養(yǎng)12周后，再分為頸動(dòng)脈置管亞組、TLR4干擾亞組和不處理亞組，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)12周。 3.病理學(xué)觀察：主動(dòng)脈樹整體染色、頭臂干動(dòng)脈斑塊連續(xù)切片，左腎動(dòng)脈石臘切片，進(jìn)行HE、油紅、免疫組化/熒光染色等染色，觀察如下指標(biāo)： （1）慢病毒轉(zhuǎn)染效率:熒光顯微鏡觀察斑塊及腎組織GFP的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR分析TLR4mRNA的表達(dá)； （2）新生內(nèi)膜形成：觀察頸動(dòng)脈置管后誘發(fā)的新生內(nèi)膜形成情況； （3）免疫組化分析腹主動(dòng)脈血管外膜BAFF的定位表達(dá)；腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)油紅染色分析脂質(zhì)吞噬功能； （4）斑塊負(fù)荷：en face油紅染色分析主動(dòng)脈樹斑塊數(shù)目與大小、斑塊的面積百分比； （5）斑塊易損性：分析斑塊脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞、膠原纖維、和平滑肌細(xì)胞含量，計(jì)算易損指數(shù)：易損指數(shù)=(巨噬細(xì)胞+脂質(zhì))陽性面積百分比／(平滑肌細(xì)胞+膠原)陽性面積百分比； （6）普魯氏藍(lán)染色染色觀察斑塊內(nèi)出血等發(fā)生情況，TUNEL染色分析斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡程度。 （7）腎組織HE染色觀察腎損傷情況及IgG、C3免疫熒光染色評估腎免疫復(fù)合物沉積。 4．分子生物學(xué)觀察 （1）Western blot檢測： 取主動(dòng)脈組織，提取蛋白質(zhì)，Western blot檢測斑塊內(nèi)HMGB1、TLR4、IRF3、MyD88、TRIF、NF-κB蛋白表達(dá)。 （2）實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測： 取新鮮頸動(dòng)脈斑塊組織，提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)檢測斑塊內(nèi)TLR4、IL-4、IL-12、IFN-β、MCP-1和TNF-α mRNA的表達(dá)水平。 （3）自身抗體抗ds-DAN、抗Sm抗體滴度及血脂水平的測定 采用ELISA檢測ds-DAN、抗Sm抗體滴度、生物化學(xué)方法測血膽固醇、甘油三酯水平。 結(jié)果 1.TLR4mRNA基因表達(dá)沉默率達(dá)89.5％。 2.降植烷促進(jìn)頸動(dòng)脈套管后新生內(nèi)膜的生成：AS-p組內(nèi)膜厚度是A-p組的1.25倍，而S-p組內(nèi)膜是C-p組的1.55倍。 3.烷誘導(dǎo)血管外膜BAFF高表達(dá)，同時(shí)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)。 4.AS組斑塊占主動(dòng)脈表面積的百分比是A組的1.83倍，TLR4阻斷治療后，AST組斑塊負(fù)荷降低了26.5%， AT組斑塊負(fù)荷降低了29.6%。 5.降植烷影響斑塊易損性：AS組、A組、AST組和AT組易損指數(shù)分別為3.41±0.44，2.71±0.38，2.13±0.25，1.38±0.19，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6.降植烷加速斑塊內(nèi)出血：AS空載體組斑塊內(nèi)出血發(fā)生率為40.5％，明顯高于A組2.0%、降植烷促進(jìn)斑塊凋亡：AS組空載體組小鼠無名動(dòng)脈斑塊內(nèi)TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著高于A組(41.8±3.9%vs24.9±3.1%)。采用RNAi治療后，與相對應(yīng)的空載體組相比，AST組和AT組斑塊內(nèi)TUNEL陽性細(xì)胞比例分別降低了22.2%、29.3%。 7.降植烷及apoE基因敲除加速腎臟組織損傷及免疫復(fù)合物沉積，AS組血清中抗ds-DNA抗體、抗Sm抗體水平均明顯高于C組、A組和S組，且AS組較S組升高更顯著（P0.05）。與C組空白對照組比較，A組中ds-DNA抗體、S組抗Sm抗體增高，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但A組抗Sm抗體、S組中ds-DNA抗體，與空白對照組比較，血清滴度有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而降植烷對血脂無明顯影響。 8.WB示降植烷不同程度上調(diào)主動(dòng)脈組織HMGB1、TLR4、 MyD88與TRIF， NF-κB與IRF3表達(dá)。 9.主動(dòng)脈TLR-4、TNF-α、MCP-1、IFN-β、IL-4、IL-12mRNA在AS組明顯增高，RNA干擾治療后，顯著降低。 結(jié)論 1.降植烷可加速apoE-/-小鼠頸動(dòng)脈套管誘發(fā)的新生內(nèi)膜形成，增加斑塊負(fù)荷及斑塊不穩(wěn)定性，導(dǎo)致腹主動(dòng)脈外膜BAFF，增加斑塊凋亡； 2.apoE基因敲除協(xié)同降植烷導(dǎo)致anti-ds-DNA、anti-Sm自身抗體增加，腎IgG及C3沉積； 3.主動(dòng)脈HMGBI-TLR4-MyD88-NF-κB通路活化是導(dǎo)致SLE中AS加速的分子機(jī)制，本研究結(jié)果為深入探討AS新的發(fā)病機(jī)制及潛在治療途徑提供了新的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R593.24;R543.5;R-332

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉偉偉;系統(tǒng)性紅斑狼瘡中載脂蛋白E與疾病活動(dòng)性及細(xì)胞因子相關(guān)性的研究[D];山東大學(xué);2013年

本文編號：2736384