本文關(guān)鍵詞：抗CD20抗體在CHO細胞內(nèi)的高表達及其定點偶聯(lián)MMAE的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一.應(yīng)用GC-rich載體提高CHO細胞表達抗CD20抗體的能力 構(gòu)建合適的高表達載體是提高CHO等哺乳動物細胞表達外源重組蛋白能力的有效手段。目前工業(yè)生產(chǎn)上使用最多的高表達載體主要有兩類：一類以二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)為篩選因子；另一類則以谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)為篩選因子。這兩類載體都是基于基因共擴增的原理達到增加目的基因拷貝數(shù)進而提高表達量的目的,但是這兩類載體都存在篩選過程冗長,同時篩選壓力移除后表達不穩(wěn)定的問題。因此開發(fā)新型的高表達載體依然是我們所面臨的任務(wù)。大量文獻已經(jīng)報道Sp家族蛋白和Kruppel家族蛋白是真核細胞中兩類十分重要的轉(zhuǎn)錄因子,它們被證實通過與GC box相結(jié)合調(diào)節(jié)目的基因的表達水平�；谏鲜鍪聦�,本實驗通過在普通載體的表達框附近添加富含GC的片段構(gòu)建了GC-rich載體,并用該載體分別攜帶抗CD20抗體的輕鏈基因和重鏈基因,共轉(zhuǎn)染進CHO細胞中,經(jīng)G418篩選兩周,隨機克隆,并且與GC-rich(-)對照載體進行同步比較,結(jié)果顯示使用GC-rich載體挑取的克隆陽性率為47%(45/96),而使用對照載體篩選到陽性克隆率僅為6%(6/96)；ELISA同步檢測,OD450最大值分別為0.62和0.37。繼續(xù)將所挑取的高表達細胞克隆(CHO-2F2-K2)放大培養(yǎng),表達3天,可獲得抗體表達量為33mg/L,比本實驗室原先的抗體表達水平提高10倍以上。由此,我們初步得到以下結(jié)論：GC-rich片段不僅增加了篩選克隆的陽性率,并且確實一定程度上提高CHO細胞表達抗CD20抗體的能力。 二.CHO細胞懸浮培養(yǎng) 抗體表達過程中,活細胞的密度是影響表達量的重要因素之一。為了進一步提高抗CD20抗體的表達水平,同時考慮到動物血清存在成分不明確(可能攜帶有牛病毒或未知毒素等不穩(wěn)定因子)以及價格昂貴等不利因素,我們采取逐步降低血清濃度的方式馴化細胞克隆株CHO-2F2-K2,馴化兩個月后,細胞株完全適應(yīng)無血清培養(yǎng)基EX-CELL302,最大活細胞密度可達1.6×106cells/ml,抗體表達量達到96mg/L。進而采用批次補料的策略培養(yǎng)表達,最大活細胞密度增至5.3×106cells/ml,抗體表達量也相應(yīng)增加到154mg/L,相比于未補料的搖瓶培養(yǎng)分別提高了230%和60%。為了與工業(yè)化生產(chǎn)接軌,我們又在5L攪拌式生物反應(yīng)器中做了批次補料發(fā)酵的初步實驗,結(jié)果最大活細胞密度和抗體表達量分別達到了6.4×106cells/ml和200mg/L。綜上所述,我們馴化了細胞克隆CHO-2F2-K2,從而提高了蛋白表達過程中的活細胞密度,并且在生物反應(yīng)器中通過批次補料的方式表達抗CD20抗體,初步實現(xiàn)了100-200mg/L的表達水平,為接下來的工藝優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。 三.抗CD20抗體定點偶聯(lián)小分子藥物的研究 抗體偶聯(lián)藥物,簡稱ADCs,是一類將抗癌制劑偶聯(lián)于抗體的生物藥物。與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物相比,ADCs具有靶向性更強,毒副作用更小的優(yōu)點,目前已在臨床顯示出極大的應(yīng)用價值,并且有望成為未來人類對抗癌癥的強力武器。但是傳統(tǒng)的以賴氨酸的側(cè)鏈胺基或鏈間二硫鍵還原巰基結(jié)合藥物的偶聯(lián)方式會導(dǎo)致產(chǎn)物的不均一,而且可能破壞抗體固有的結(jié)構(gòu)降低其親和性。本實驗參考Jagath R Junutula等人的設(shè)計思路在抗CD20抗體2F2上突變產(chǎn)生四個可用于偶聯(lián)的半胱氨酸殘基,突變抗體HLM經(jīng)GC-rich-CHO系統(tǒng)表達。初步檢測親和性后,將HLM與vcMMAE偶聯(lián),HPLC分析產(chǎn)物純度,紫外可見分光光度儀檢測偶聯(lián)比,進一步流式細胞儀檢測偶聯(lián)物的親和性以及細胞活性。結(jié)果表明：HLM-vcMMAE不僅保持了原抗體2F2的親和力,并且直接殺傷細胞的能力比原抗體提高很多。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文縮略詞表10-14
• 第一章 緒論14-21
• 1.1 單克隆抗體14-16
• 1.2 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)16-18
• 1.3 GC-rich載體在哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中的應(yīng)用18-19
• 1.4 抗體定點偶聯(lián)小分子藥物19-20
• 1.5 本研究主要創(chuàng)新點20-21
• 第二章 GC-rich載體用于提高CHO細胞表達全人源抗CD20抗體2F2的研究21-48
• 2.1 前言21-22
• 2.2 實驗材料及基本操作22-30
• 2.2.1 材料與試劑22
• 2.2.2 實驗菌株和細胞22
• 2.2.3 實驗儀器22-23
• 2.2.4 相關(guān)溶液的配制23-28
• 2.2.5 基本操作28-30
• 2.3 實驗步驟與方法30-40
• 2.3.1 重組表達質(zhì)粒pMH3-H和pMH3-L的構(gòu)建30-38
• 2.3.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細胞38-39
• 2.3.3 藥物篩選與穩(wěn)定單克隆株挑取39
• 2.3.4 CHO(2F2)的貼壁表達與純化39-40
• 2.4 實驗結(jié)果40-46
• 2.4.1 真核表達載體構(gòu)建40-42
• 2.4.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗42
• 2.4.3 單克隆篩選實驗42-44
• 2.4.4 GC-rich(+)真核表達載體與GC-rich(-)真核表達載體的比較44-45
• 2.4.5 抗CD20抗體2F2的表達與純化45-46
• 2.5 討論46-48
• 第三章 重組CHO細胞的無血清懸浮培養(yǎng)48-63
• 3.1 前言48-49
• 3.2 實驗儀器和實驗試劑49-55
• 3.2.1 細胞和試劑49
• 3.2.2 實驗儀器49-50
• 3.2.3 相關(guān)溶液配制50-53
• 3.2.4 基礎(chǔ)操作53-55
• 3.3 實驗方法55-57
• 3.3.1 重組CHO細胞無血清馴化和懸浮培養(yǎng)55-56
• 3.3.2 搖瓶培養(yǎng)56
• 3.3.3 搖瓶批次補料培養(yǎng)56-57
• 3.3.4 生物反應(yīng)器批次補料培養(yǎng)57
• 3.4 實驗結(jié)果57-62
• 3.4.1 重組CHO細胞的無血清馴化與搖瓶表達57-60
• 3.4.2 搖瓶批次補料表達60-61
• 3.4.3 5-L生物反應(yīng)器批次補料表達61-62
• 3.5 討論62-63
• 第四章 抗CD20抗體定點偶聯(lián)小分子藥物MMAE63-80
• 4.1 前言63-64
• 4.2 實驗材料及基本操作64-65
• 4.2.1 材料與試劑64
• 4.2.2 實驗菌株和細胞64
• 4.2.3 實驗儀器64-65
• 4.2.4 相關(guān)溶液的配制65
• 4.2.5 基本操作65
• 4.3 實驗步驟和方法65-72
• 4.3.1 構(gòu)建表達質(zhì)粒pMH3-LV205C和pMH3-HA123C67-70
• 4.3.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細胞70
• 4.3.3 藥物篩選與穩(wěn)定單克隆株挑取70
• 4.3.4 CHO(HLM)的貼壁表達與純化70-71
• 4.3.5 抗體HLM與小分子藥物vcMMAE偶聯(lián)71
• 4.3.6 流式細胞儀檢測2F2,HLM及HLM-vcMMAE的親和性71
• 4.3.7 細胞毒性檢測71-72
• 4.4 實驗結(jié)果72-79
• 4.4.1 點突變72-73
• 4.4.2 細胞轉(zhuǎn)染與克隆篩選73-74
• 4.4.3 抗體HLM表達與純化74
• 4.4.4 抗體偶聯(lián)物HLM-vcMMAE的合成74-79
• 4.5 討論79-80
• 結(jié)論80-81
• 參考文獻81-87
• 綜述：抗體在CHO細胞內(nèi)的高表達策略87-103
• References99-103
• 作者簡歷及在讀期間主要研究成果103

  本文關(guān)鍵詞：抗CD20抗體在CHO細胞內(nèi)的高表達及其定點偶聯(lián)MMAE的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：273020