本文關鍵詞：轉錄因子Foxp3對RAW264.7細胞表型及免疫抑制相關基因作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來，隨著醫(yī)療水平的不斷提高，移植技術已成為治療疾病的重要手段，但由移植物所引起的移植排斥現(xiàn)象的出現(xiàn)成為阻礙移植技術成功的重要因素，因此，阻止移植排斥現(xiàn)象的出現(xiàn)保證移植技術成功就成為當今醫(yī)學在移植技術領域迫在眉睫的任務。 轉錄因子Foxp3（Forkhead box protein3）特異性的表達在調節(jié)性T細胞（RegulatoryT cells,Tregs）上，并且它在Tregs的分化、發(fā)育和維持抑制功能方面起著關鍵性作用。而在移植耐受模型體內Tregs抑制了效應細胞的活化并且控制效應細胞對移植物的應答，目前，Tregs被認為是在實體器官移植治療方面一種有潛力的治療手段。Tregs在移植物的同種異體應答的不同階段發(fā)揮它們的調節(jié)功能，體內和體外實驗對Tregs增殖的研究進展為Tregs在移植物治療方面提供了新的進展。 MDSC（myeloid-derived suppressor cell）是一類異質細胞群，它是由巨噬細胞、粒細胞以及處于不同成熟階段的樹突狀細胞組成。已有研究證實在移植排斥中，MDSC擁有與Tregs細胞相似的角色。MDSC可以抑制效應T細胞的增殖同時可以通過iNOS依賴的方式來誘導接觸依賴性的細胞凋亡。iNOS抑制劑可以誘導對耐受移植物的排斥，從而證實了iNOS在MDSC抑制功能中的重要作用。同樣有研究證實骨髓來源的MDSC可以通過Arg1依賴途徑抑制移植物抗宿主疾病的發(fā)生，從而證實MDSC在移植排斥中發(fā)揮重要作用。 基于上述背景，我們設想將轉錄因子Foxp3轉染到小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞后，可使RAW264.7細胞通過模擬Tregs和MDSC的作用，參與免疫反應的負性調節(jié)，從而為移植排斥的治療提供新的細胞治療措施。為此，本研究從以下三個方面展開：1.穩(wěn)定表達Foxp3的巨噬細胞RAW264.7模型的建立 首先構建真核表達載體pIRES2-EGFP/mFoxp3，經過轉染、篩選及鑒定，得到了穩(wěn)定表達GFP-Foxp3蛋白的RAW264.7細胞（F7-1-14）以及穩(wěn)定表達GFP蛋白的RAW264.7細胞（IRES2），為接下來的實驗奠定基礎。2．過表達Foxp3的RAW264.7細胞表面標志（CTLA-4、GITR及GITRL）的變化 為了探討將Foxp3基因轉染到巨噬細胞系RAW264.7細胞后，RAW264.7細胞中與Tregs的免疫抑制功能相關分子CTLA-4及GITR的表達變化，我們采用半定量RT-PCR的方法檢測F7-1-14細胞、IRES2細胞及RAW264.7細胞CTLA-4及GITR的mRNA的表達情況，結果顯示，與IRES2細胞及RAW264.7細胞相比，， F7-1-14細胞CTLA-4及GITR的mRNA表達水平明顯增加。結果說明Foxp3能夠促進巨噬細胞系RAW264.7細胞中與Tregs的免疫抑制功能相關的表面分子CTLA-4及GITR的表達，從而參與免疫反應的負性調節(jié)。在此過程中，我們還發(fā)現(xiàn)F7-1-14細胞的GITRL的mRNA表達水平比IRES2細胞及RAW264.7細胞明顯升高。我們推測轉染Foxp3的RAW264.7細胞表面的GITRL分子可以與Tregs細胞表面的GITR分子結合，通過激活下游的通路達到促進Tregs的增殖能力，從而進一步維持免疫調節(jié)和機體耐受。由此我們推測，將小鼠的轉錄因子Foxp3轉染到RAW264.7細胞后，此細胞可能通過模擬Tregs的功能作用，從而參與免疫反應的負性調節(jié)。3．過表達Foxp3的RAW264.7細胞免疫抑制相關基因（iNOS、Arg1）表達的變化 為了探討將Foxp3基因轉染到巨噬細胞系RAW264.7細胞后，是否影響RAW264.7細胞中與MDSC的免疫抑制功能相關分子iNOS及Arg1的表達，我們采用實時定量PCR的方法檢測了F7-1-14細胞、IRES2細胞及RAW264.7細胞中iNOS及Arg1的表達情況，結果顯示，與IRES2細胞及RAW264.7細胞相比，F(xiàn)7-1-14細胞中iNOS及Arg1的mRNA表達水平明顯增加。這說明Foxp3能夠增強巨噬細胞系RAW264.7細胞中免疫抑制功能相關分子iNOS和Arg1的mRNA表達，通過iNOS依賴的方式誘導接觸依賴性的細胞凋亡及Arg1依賴途徑，從而抑制移植物抗宿主疾病的發(fā)生。由此我們推測，將小鼠的轉錄因子Foxp3轉染到RAW264.7細胞后，此細胞可能通過模擬MDSC的功能作用，從而發(fā)揮抑制移植物抗宿主疾病的發(fā)生。 本研究意義在于使巨噬細胞擁有免疫抑制的能力，從而為移植排斥的治療提供了新的細胞治療措施。
【關鍵詞】：Foxp3 Tregs MDSC 巨噬細胞 移植排斥
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 提要4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-14
• 英文縮寫詞14-15
• 引言15-17
• 文獻綜述17-29
• 一、Foxp3 的研究進展17-21
• 1、Foxp3 的結構17
• 2、Foxp3 與 Tregs17-19
• 3、Tregs 與移植排斥的關系19-21
• 二、MDSC 的研究進展21-29
• 1、MDSC 的組成21-23
• 2、MDSC 的免疫抑制機制23-26
• 3、MDSC 與移植排斥的關系26-29
• 課題設計思路及實驗方案29-31
• 實驗研究31-58
• 一、材料31-35
• 1. 細胞株31
• 2. 質粒和菌株31
• 3. 實驗試劑31-32
• 4. 實驗儀器32-33
• 5. 主要試劑的配制33-35
• 二、方法35-43
• 1. RAW264.7 細胞的培養(yǎng)35
• 2. 逆轉錄-聚合酶鏈反應（Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）35-37
• 3. 真核表達質粒 pIRES2-EGFP/mFoxp3 的構建37-39
• 4. 真核表達質粒的轉染與穩(wěn)定表達細胞系的篩選39-40
• 5. 流式細胞術（Flow cytometry, FCM）40-41
• 6. RT-PCR 檢測41-42
• 7. 實時定量 PCR 檢測42
• 8. 結果統(tǒng)計分析42-43
• 三、實驗結果43-54
• 1. 建立穩(wěn)定表達 Foxp3 的 RAW264.7 細胞系43-49
• 2. 過表達 Foxp3 的 RAW264.7 細胞表面標志的變化49-53
• 3. 過表達 Foxp3 的 RAW264.7 細胞免疫抑制相關基因表達的變化53-54
• 四、討論54-57
• 五、結論57
• 六、有待于進一步研究的工作57-58
• 參考文獻58-66
• 作者簡介及在學期間所取得的科研成果66-67
• 致謝67

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  本文關鍵詞：轉錄因子Foxp3對RAW264.7細胞表型及免疫抑制相關基因作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：271927