本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子Foxp3對RAW264.7細(xì)胞表型及免疫抑制相關(guān)基因作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來，隨著醫(yī)療水平的不斷提高，移植技術(shù)已成為治療疾病的重要手段，但由移植物所引起的移植排斥現(xiàn)象的出現(xiàn)成為阻礙移植技術(shù)成功的重要因素，因此，阻止移植排斥現(xiàn)象的出現(xiàn)保證移植技術(shù)成功就成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)在移植技術(shù)領(lǐng)域迫在眉睫的任務(wù)。 轉(zhuǎn)錄因子Foxp3（Forkhead box protein3）特異性的表達(dá)在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（RegulatoryT cells,Tregs）上，并且它在Tregs的分化、發(fā)育和維持抑制功能方面起著關(guān)鍵性作用。而在移植耐受模型體內(nèi)Tregs抑制了效應(yīng)細(xì)胞的活化并且控制效應(yīng)細(xì)胞對移植物的應(yīng)答，目前，Tregs被認(rèn)為是在實(shí)體器官移植治療方面一種有潛力的治療手段。Tregs在移植物的同種異體應(yīng)答的不同階段發(fā)揮它們的調(diào)節(jié)功能，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對Tregs增殖的研究進(jìn)展為Tregs在移植物治療方面提供了新的進(jìn)展。 MDSC（myeloid-derived suppressor cell）是一類異質(zhì)細(xì)胞群，它是由巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞以及處于不同成熟階段的樹突狀細(xì)胞組成。已有研究證實(shí)在移植排斥中，MDSC擁有與Tregs細(xì)胞相似的角色。MDSC可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖同時(shí)可以通過iNOS依賴的方式來誘導(dǎo)接觸依賴性的細(xì)胞凋亡。iNOS抑制劑可以誘導(dǎo)對耐受移植物的排斥，從而證實(shí)了iNOS在MDSC抑制功能中的重要作用。同樣有研究證實(shí)骨髓來源的MDSC可以通過Arg1依賴途徑抑制移植物抗宿主疾病的發(fā)生，從而證實(shí)MDSC在移植排斥中發(fā)揮重要作用。 基于上述背景，我們設(shè)想將轉(zhuǎn)錄因子Foxp3轉(zhuǎn)染到小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞后，可使RAW264.7細(xì)胞通過模擬Tregs和MDSC的作用，參與免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)，從而為移植排斥的治療提供新的細(xì)胞治療措施。為此，本研究從以下三個(gè)方面展開：1.穩(wěn)定表達(dá)Foxp3的巨噬細(xì)胞RAW264.7模型的建立 首先構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP/mFoxp3，經(jīng)過轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定，得到了穩(wěn)定表達(dá)GFP-Foxp3蛋白的RAW264.7細(xì)胞（F7-1-14）以及穩(wěn)定表達(dá)GFP蛋白的RAW264.7細(xì)胞（IRES2），為接下來的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。2．過表達(dá)Foxp3的RAW264.7細(xì)胞表面標(biāo)志（CTLA-4、GITR及GITRL）的變化 為了探討將Foxp3基因轉(zhuǎn)染到巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞后，RAW264.7細(xì)胞中與Tregs的免疫抑制功能相關(guān)分子CTLA-4及GITR的表達(dá)變化，我們采用半定量RT-PCR的方法檢測F7-1-14細(xì)胞、IRES2細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞CTLA-4及GITR的mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與IRES2細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞相比，， F7-1-14細(xì)胞CTLA-4及GITR的mRNA表達(dá)水平明顯增加。結(jié)果說明Foxp3能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中與Tregs的免疫抑制功能相關(guān)的表面分子CTLA-4及GITR的表達(dá)，從而參與免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)。在此過程中，我們還發(fā)現(xiàn)F7-1-14細(xì)胞的GITRL的mRNA表達(dá)水平比IRES2細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞明顯升高。我們推測轉(zhuǎn)染Foxp3的RAW264.7細(xì)胞表面的GITRL分子可以與Tregs細(xì)胞表面的GITR分子結(jié)合，通過激活下游的通路達(dá)到促進(jìn)Tregs的增殖能力，從而進(jìn)一步維持免疫調(diào)節(jié)和機(jī)體耐受。由此我們推測，將小鼠的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞后，此細(xì)胞可能通過模擬Tregs的功能作用，從而參與免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)。3．過表達(dá)Foxp3的RAW264.7細(xì)胞免疫抑制相關(guān)基因（iNOS、Arg1）表達(dá)的變化 為了探討將Foxp3基因轉(zhuǎn)染到巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞后，是否影響RAW264.7細(xì)胞中與MDSC的免疫抑制功能相關(guān)分子iNOS及Arg1的表達(dá)，我們采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測了F7-1-14細(xì)胞、IRES2細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞中iNOS及Arg1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與IRES2細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞相比，F(xiàn)7-1-14細(xì)胞中iNOS及Arg1的mRNA表達(dá)水平明顯增加。這說明Foxp3能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中免疫抑制功能相關(guān)分子iNOS和Arg1的mRNA表達(dá)，通過iNOS依賴的方式誘導(dǎo)接觸依賴性的細(xì)胞凋亡及Arg1依賴途徑，從而抑制移植物抗宿主疾病的發(fā)生。由此我們推測，將小鼠的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞后，此細(xì)胞可能通過模擬MDSC的功能作用，從而發(fā)揮抑制移植物抗宿主疾病的發(fā)生。 本研究意義在于使巨噬細(xì)胞擁有免疫抑制的能力，從而為移植排斥的治療提供了新的細(xì)胞治療措施。
【關(guān)鍵詞】：Foxp3 Tregs MDSC 巨噬細(xì)胞 移植排斥
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 提要4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-14
• 英文縮寫詞14-15
• 引言15-17
• 文獻(xiàn)綜述17-29
• 一、Foxp3 的研究進(jìn)展17-21
• 1、Foxp3 的結(jié)構(gòu)17
• 2、Foxp3 與 Tregs17-19
• 3、Tregs 與移植排斥的關(guān)系19-21
• 二、MDSC 的研究進(jìn)展21-29
• 1、MDSC 的組成21-23
• 2、MDSC 的免疫抑制機(jī)制23-26
• 3、MDSC 與移植排斥的關(guān)系26-29
• 課題設(shè)計(jì)思路及實(shí)驗(yàn)方案29-31
• 實(shí)驗(yàn)研究31-58
• 一、材料31-35
• 1. 細(xì)胞株31
• 2. 質(zhì)粒和菌株31
• 3. 實(shí)驗(yàn)試劑31-32
• 4. 實(shí)驗(yàn)儀器32-33
• 5. 主要試劑的配制33-35
• 二、方法35-43
• 1. RAW264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)35
• 2. 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）35-37
• 3. 真核表達(dá)質(zhì)粒 pIRES2-EGFP/mFoxp3 的構(gòu)建37-39
• 4. 真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的篩選39-40
• 5. 流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry, FCM）40-41
• 6. RT-PCR 檢測41-42
• 7. 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測42
• 8. 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析42-43
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-54
• 1. 建立穩(wěn)定表達(dá) Foxp3 的 RAW264.7 細(xì)胞系43-49
• 2. 過表達(dá) Foxp3 的 RAW264.7 細(xì)胞表面標(biāo)志的變化49-53
• 3. 過表達(dá) Foxp3 的 RAW264.7 細(xì)胞免疫抑制相關(guān)基因表達(dá)的變化53-54
• 四、討論54-57
• 五、結(jié)論57
• 六、有待于進(jìn)一步研究的工作57-58
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果66-67
• 致謝67

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  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子Foxp3對RAW264.7細(xì)胞表型及免疫抑制相關(guān)基因作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：271927