本文關(guān)鍵詞：慢性生長激素對肝臟STAT5信號的調(diào)節(jié)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 生長激素(growth hormone, GH)是人體一種重要的激素,在出生后的生長、代謝、老化及腫瘤的形成過程中發(fā)生重要作用。 GH已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于臨床治療。最初,GH主要應(yīng)用于GH缺乏癥的治療,后來逐漸推廣到其它疾病的治療,例如,腸外瘺、肝硬化門脈高壓、急性壞死性胰腺炎、重癥感染、擴張性心肌病、呼吸功能衰竭、慢性腎病等等。隨著應(yīng)用范圍的擴大,GH的療效及可能的副作用得到了越來越多的關(guān)注,包括生長激素激素抵抗、白血病、腫瘤等。為了更好地了解臨床副作用的機制,必然要深入到分子層面的研究。 GH在體內(nèi)最重要的靶器官是肝臟。GH通過janus酪氨酸蛋白激酶2(anus tyrosine protein kinase2, JAK2)/信號激活下游信號通路。轉(zhuǎn)錄因子STAT5(Signal transducer and activators of transcription5)是GH在體內(nèi)調(diào)節(jié)代謝作用的主要效應(yīng)因子。正常情況下,GH與GHR結(jié)合,JAK2可與GHR的胞內(nèi)段結(jié)合而發(fā)生自身磷酸化,然后磷酸化GHR,形成GH-GHR-JAK2的多聚體結(jié)合,為STAT5提供對接位點,STAT5磷酸化后,形成二聚體,轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi),與靶基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點結(jié)合,調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。而對GH-JAK2/STAT5信號通路負(fù)調(diào)解機制的研究目前多集中于GHR水平,及細(xì)胞因子抑制物(Suppressor of cytokine signaling, SOCS)家族以及調(diào)節(jié)因子蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(Src homology2domain containing phosphotyrosine phosphatase2, SHP2)。 SHP2對生長激素的調(diào)節(jié)研究報道很少,有個別報道認(rèn)為SHP2可和生長激素受體結(jié)合。但SHP2可和生長激素受體結(jié)合的生理病理意義還不清楚。為了更好地了解慢性GH治療對機體可能產(chǎn)生的副作用及機制,本研究采用HepG2細(xì)胞實驗及正常的幼年BALB/c小鼠,是許多其它已經(jīng)發(fā)表的不同模型研究的一個補充。 目的 本課題通過體內(nèi)外實驗研究急慢性生長激素刺激對STAT5信號的調(diào)節(jié)作用,探索GH抵抗的分子機制,及SHP2可能的作用。 方法 一、細(xì)胞實驗部分 1、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,細(xì)胞傳代均勻鋪4個孔,把4孔分為2組Control組和急性GH刺激組,每組2孔,待細(xì)胞長至約90%后,予血清饑餓12小時,裂解細(xì)胞前20分鐘予以急性GH刺激組GH刺激(GH濃度儲存濃度為1.33mg/ml,工作濃度為2000ng/ml,用無血清DMEM液稀釋),予以對照組等體積的無血清DMEM培養(yǎng)液,裂解細(xì)胞提取總蛋白,Western blot蛋白分析法檢測p-STAT5、STAT5蛋白表達(dá)水平。 2、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,細(xì)胞傳代均勻鋪4個孔,把4孔分為2組Control組和慢性GH刺激組,每組2孔,待細(xì)胞長至約90%后,予血清饑餓12小時,裂解細(xì)胞前6小時慢性GH刺激組予以GH刺激,予以對照組等體積無血清DMEM培養(yǎng)液,至裂解前20分鐘實驗組及對照組均予以GH刺激,裂解細(xì)胞提取總蛋白,Western blot蛋白分析法檢測p-STAT5、STAT5蛋白表達(dá)水平。 3、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞傳代均勻鋪2個60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿,隨機分為GH刺激組和Control組,待細(xì)胞長至約90%后,予血清饑餓12小時,裂解細(xì)胞前6小時實驗組予以GH刺激,對照組予以等體積的無血清DMEM培養(yǎng)液,裂解細(xì)胞,提取總蛋白。免疫共沉淀分析法(CO-IP)檢測胞質(zhì)內(nèi)與CIS結(jié)合的GHR的表達(dá)水平。 4、統(tǒng)計分析：所有結(jié)果經(jīng)Excel2010及SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(：arithmetic mean±standard deviation,M±SD)"表示。兩組間比較若方差齊采用兩獨立樣本t檢驗(Independent-Samples T Test),若方差不齊則采用Satterthwaite近似r檢驗,以P0.05視為有顯著性差異。 二、動物實驗部分 1、實驗設(shè)計：6-8周正常幼年BALB/c小鼠32只,隨機編號為1-32,測量空腹體重。隨機分為兩組：對照組和慢性GH組,每組16只,對照組每天注射0.2ml PBS,'慢性GH組每天按1μg/g體重劑量(溶于0.2ml PBS)腹腔注射rhGH,給藥3周。完成3周慢性生長激素刺激后,臨處死前一天晚上23：00饑餓小鼠,并保證飲水充足。處死前凌晨8點,把對照組和慢性GH組分別隨機分成非急性GH組(PBS+PBS組、慢性GH+PBS組)和急性GH組(PBS+急性GH組、慢性GH+急性GH組)。非急性GH組臨處死前20分鐘予腹腔注射PBS0.2ml,急性GH組予以腹腔注射生長激素一次(1μg/g)。操作時對照組和慢性GH兩組交替進(jìn)行,先處理非急性生長激素組后處理急性生長激素組。處死前使用麻醉劑苯巴比妥充分麻醉后,快速摘取肝臟置入液氮中速凍,再移至-80℃冰箱長期保存?zhèn)溆谩?2、比較慢性GH和對照組兩組各16只小鼠體重增長情況。 3、比較對照組和慢性GH組肝內(nèi)基礎(chǔ)STAT5及p-STAT5水平。低溫研磨非急性GH組(即PBS+PBS組、慢性GH+PBS組)肝臟綠豆大小組織,提取蛋白,western blot檢測STAT5及p-STAT5水平。 4、檢測急性GH刺激對慢性GH組STAT5磷酸化水平的影響。低溫研磨慢性GH組(包括慢性GH+PBS組,慢性GH+急性GH組)肝臟綠豆大小組織,提取蛋白,western blot檢測STAT5及p-STAT5水平。 5、比較對照組及慢性GH組中急性GH刺激后的肝內(nèi)STAT5及p-STAT5水平。低溫研磨急性GH組(包括PBS+急性GH組,慢性GH+急性GH組)肝臟綠豆大小組織,提取蛋白,western blot檢測STAT5及p-STAT5水平。 6、在無急性GH刺激時,比較對照組及慢性GH組GHR及SHP2表達(dá)。低溫研磨非急性GH組(包括PBS+PBS組、慢性GH+PBS組)肝臟綠豆大小組織,提取蛋白,western blot檢測GHR及SHP2水平。 7、比較對照組及慢性GH組在無急性GH刺激時GHR與SHP2相互結(jié)合的情況。低溫研磨非急性GH組(包括PBS+PBS組、慢性GH+PBS組)肝臟綠豆大小組織,按CO-IP步驟提取蛋白,以針對SHP2的蛋白沉淀肝臟SHP2蛋白,然后以western blot檢測沉淀蛋白中的GHR水平。 8、統(tǒng)計分析：所有結(jié)果經(jīng)Exce12010及SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(arithmetic mean±standard deviation,M±SD)”表示。兩組間比較若方差齊則采用兩獨立樣本t檢驗(Independent-Samples T Test),方差不齊則采用Satterthwaite近似t檢驗。P-STAT5、STAT5蛋白表達(dá)水平的比較采用t檢驗,經(jīng)Bonferroni校正以P0.017視為有顯著性差異。GHR與SHP2的測定為兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,以P值0.05視為有顯著性差異。 結(jié)果 一、細(xì)胞實驗結(jié)果 1、Western blot檢測結(jié)果顯示急性GH刺激組較Control組p-STAT5蛋白表達(dá)水平顯著提高(t=-22.649,P=0.000),Western blot以GAPDH作內(nèi)參,兩組灰度比值比分別為0.513±0.052及0.029±0.008,STAT5蛋白無顯著差異,兩組灰度值比值為1.225±0.088及1.146±0.102忙-1.473,P=0.181)。 2、在予以6個小時慢性刺激的慢性GH刺激組,以及予以等體積DMEM對照的Control組,臨裂解前20分鐘全部予以20分鐘急性GH刺激,慢性GH刺激組較Control組p-STAT5水平顯著降低(灰度比值比分別為0.237±0.043和0.959±0.298,t=5.868,P=0.000),而STAT5水平未見顯著差異,兩組灰度值比分別為0.875±0.086及0.788±0.079(t=-1.824,P=0.098),Western blot以GAPDH作內(nèi)參。 3、CO-IP結(jié)果顯示,慢性GH刺激組與Control組相比,與胞漿內(nèi)CIS結(jié)合的GHR蛋白表達(dá)水平顯著升高(t=14.016,P,=0.000),兩組灰度值比值分別為1.896±0.193及0.222±0.075。 二、動物實驗結(jié)果 1、慢性GH刺激導(dǎo)致小鼠體重增加,慢性GH組和對照組的小鼠相比,慢性GH組小鼠平均增加體重比PBS對照組小鼠重1.278g(t=-3.667,P=0.001)。兩組灰度值比值分別為3.883±0.962及2.605±1.008。 2、慢性GH+PBS組小鼠肝臟細(xì)胞基礎(chǔ)的p-STAT5水平(0.367±0.124)顯著低于PBS+PBS組(1.058±0.091)(t=12.272,P=0.000)；但肝臟內(nèi)總STAT5蛋白水平無顯著差異,灰度值比值為0.741±0.157及0.799±0.086(t=0.927,P=0.370),Western blot以β-Actin作為內(nèi)參。 3、在慢性GH組中,與處死前予PBS處理的小鼠相比,急性GH可使小鼠肝臟細(xì)胞p-STAT5水平顯著升高(0.005±0.001vs0.214±0.027,t=-21.544,P=0.000),而STAT5水平無顯著差異(t=-0.251,P=0.805),兩組灰度值比值為0.625±0.046和0.632±0.060,Western blot以β-Actin作為內(nèi)參。 4、急性生長激素可使對照組及慢性GH組STAT5磷酸化,但慢性GH組的P-STAT5水平遠(yuǎn)低于PBS對照組(0.418±0.091vs0.677±0.080,t=6.036,P=0.000), STAT5水平無顯著差異(0.826±0.093vs0.811±0.073,t=-0.360,P=0.724)Western blot以P-Actin作為內(nèi)參。 5、在無急性GH刺激時,對照組與慢性GH組相比,總GHR蛋白的表達(dá)無顯著差異,灰度值比值分別為1.280±0.297及1.178±0.368(t=0.611,P=0.551)�？係HP2亦無顯著差異,灰度值比值為1.297±0.287及1.400±0.272(t=-0.741,P=0.471), Western blot以GAPDH作為內(nèi)參。 6、免疫共沉淀結(jié)果顯示,在無急性GH刺激時,慢性GH組內(nèi)與SHP2結(jié)合的GHR量較對照組高,兩組灰度比值比分別為0.537±0.090和0.282±0.113(t=-4.980,P=0.000)。 結(jié)論 在HepG2細(xì)胞內(nèi),慢性GH刺激導(dǎo)致STAT5對外源性GH的抵抗,其機制可能是GHR與胞漿內(nèi)CIS的結(jié)合增加。在小鼠體內(nèi),慢性GH刺激導(dǎo)致肝臟P-STAT5的抑制,相應(yīng)的,GHR與SHP2的結(jié)合也增加。因此,本研究認(rèn)為慢性GH刺激導(dǎo)致的GH抵抗的機制是GHR與SHP2的結(jié)合活性的增加。本研究結(jié)論的提出是文獻(xiàn)報道中根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)研究提出的GHR和SHP2結(jié)合可能抑制生長激素信號的假設(shè)的一個實例。
【關(guān)鍵詞】：生長激素 STAT5 HepG2 肝臟 GHR CIS SHP2
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R335
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 第一章 前言16-20
• 第二章 材料與方法20-41
• 一、體外實驗部分20-29
• 二、體內(nèi)實驗部分29-41
• 第三章 結(jié)果41-60
• 一、體外實驗結(jié)果41-47
• 二、體內(nèi)實驗結(jié)果47-60
• 第四章 討論60-63
• 全文小結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 中英文縮略詞對照表71-72
• 在讀期間已經(jīng)發(fā)表和將要發(fā)表的論文72-73
• 致謝73-74

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本文編號：272060