【摘要】：垂體中葉素（Intermedin，IMD）是2004年新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性小分子多肽，屬降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide, CGRP）超家族成員，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究旨在對(duì)IMD在大鼠腎小管上皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷（hypoxia/reoxygenation，H/R）中的保護(hù)作用及其機(jī)制進(jìn)行探討。分為以下兩個(gè)部分： 第一部分IMD通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用 實(shí)驗(yàn)一缺氧復(fù)氧損傷可誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生 目的：在大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E H/R模型中檢測(cè)ERS經(jīng)典分子的表達(dá)，探討ERS在腎臟IRI中的作用； 方法：常規(guī)培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，隨機(jī)分為對(duì)照組（control）、缺氧復(fù)氧組（H/R）、衣霉素組（TM）；缺氧1h，復(fù)氧2h制作細(xì)胞H/R模型。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Dapoxyl熒光染料染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)，realtime-PCR法和Western blotting法檢測(cè)ERS經(jīng)典分子GRP78、CHOP、Caspaes12mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)果：⑴H/R處理可以導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E凋亡，與正常對(duì)照組相比，H/R組和TM組細(xì)胞凋亡率顯著增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。⑵Dapoxyl染色結(jié)果可見對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均勻分布在核周，無(wú)空泡出現(xiàn)。H/R可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)受損，Dapoxyl染料濃集，熒光強(qiáng)度增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒感增強(qiáng)，熒光顆粒分布不均、濃集，并有空泡形成，其結(jié)果與TM組相同，說(shuō)明H/R可以引起ERS。⑶Realtime-PCR及Western blotting結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組相比，H/R可導(dǎo)致ERS經(jīng)典分子GRP78、CHOP、Caspase12mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P0.01），H/R組與TM組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：在大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E H/R后，細(xì)胞凋亡率升高；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光染料濃集、顆粒感增強(qiáng)；ERS相關(guān)分子GRP78、CHOP、Caspase-12mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)，提示H/R損傷過(guò)程中存在ERS凋亡途徑的活化。因此，減少過(guò)度的ERS有可能是成為腎臟IRI防治的新靶點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)二IMD通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減輕腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E缺氧復(fù)氧損傷 目的：利用穩(wěn)定表達(dá)IMD的NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行缺氧復(fù)氧實(shí)驗(yàn)，觀察IMD對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，探討其細(xì)胞保護(hù)的分子機(jī)制。 方法：腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，隨機(jī)分為對(duì)照組（control）、缺氧復(fù)氧組（H/R）、空質(zhì)粒組（H/R+pIRES2）、IMD組（H/R+IMD）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Dapoxyl熒光染料染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)，realtime-PCR法和Western blotting法檢測(cè)ERS經(jīng)典分子GRP78、CHOP、Caspaes12mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)果：⑴IMD轉(zhuǎn)染可顯著降低NRK-52E細(xì)胞凋亡率，與H/R組相比，細(xì)胞凋亡率降低12%（P0.05）；而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與H/R組之間差異無(wú)顯著性。⑵Dapoxyl染色可見，IMD轉(zhuǎn)染可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)受損。⑶Realtime-PCR及Western blotting結(jié)果證實(shí)，與H/R組相比，IMD組ERS經(jīng)典分子GRP78、CHOP、Caspase-12mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降（P0.01），H/R組與轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：IMD可以通過(guò)下調(diào)大鼠腎小管上皮細(xì)胞H/R后GRP78、CHOP、Caspase-12的表達(dá)，抑制ERS及隨后的凋亡信號(hào)通路，從而減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡，減輕腎臟IRI。 第二部分IMD對(duì)缺氧復(fù)氧后大鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖作用的影響及其信號(hào)通路研究 目的：在大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E H/R模型中研究IMD對(duì)H/R后細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響以及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白表達(dá)的變化，闡明IMD促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)及再生的機(jī)制及相關(guān)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 方法：腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，隨機(jī)分為對(duì)照組（control），模型組：缺氧/復(fù)氧組（H/R組）、空質(zhì)粒組（H/R+pIRES2）、IMD質(zhì)粒組（H/R+IMD）、IMD質(zhì)粒+PD98059組（H/R+IMD+PD）、IMD質(zhì)粒+anisomycin組（H/R+IMD+anisomycin）。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，分光光度法檢測(cè)培養(yǎng)基上清LDH含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，realtime-PCR法和Western blotting法檢測(cè)cyclin D1、cyclinE mRNA及蛋白表達(dá)，熒光素酶活性測(cè)定檢測(cè)cyclin D1啟動(dòng)子活性，電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）測(cè)定AP-1位點(diǎn)的DNA結(jié)合活性，間接免疫熒光染色檢測(cè)cyclin D1的亞細(xì)胞定位。 結(jié)果：⑴與對(duì)照組相比，H/R組培養(yǎng)基中LDH含量顯著上升，與對(duì)照組相比升高了106%。而IMD可顯著降低培養(yǎng)基中LDH含量，與H/R組及空質(zhì)粒組相比分別降低了33.85%、33.46%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；H/R組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（H/R+pIRES2）組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。⑵MTT結(jié)果顯示，H/R組NRK-52E細(xì)胞存活率較對(duì)照組明顯下降，而IMD轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率提高（80.22±4.42%vs.59.77±9.63%, P0.05），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；H/R組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（H/R+pIRES2）組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。⑶H/R可使NRK-52E細(xì)胞p-ERK、p-JNK及p-P38活性水平增加，而IMD而進(jìn)一步增加p-ERK的水平，下調(diào)p-JNK、p-P38的表達(dá)。⑷給予ERK抑制劑（PD098059）及JNK、p38通路誘導(dǎo)劑（anisomycin）后，各檢測(cè)指標(biāo)的變化如下：①PD98059抑制了ERK活性而減弱了IMD通過(guò)上調(diào)ERK表達(dá)對(duì)H/R后NRK-52E細(xì)胞增殖促進(jìn)作用，同時(shí)培養(yǎng)液中LDH含量也較轉(zhuǎn)染組增加；而anisomycin由于活化了JNK、p38活性，從而也從一定程度上減弱了IMD通過(guò)下調(diào)JNK、p38表達(dá)對(duì)H/R的NRK-52E細(xì)胞增殖促進(jìn)作用及損傷保護(hù)作用。②細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞G0/G1期比例增加，S期細(xì)胞比例降低（P0.05），說(shuō)明H/R狀態(tài)下NRK-52E細(xì)胞增殖受到抑制。與H/R比較，IMD組均表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，而S及G2期細(xì)胞比例增加（P0.05），說(shuō)明IMD可使細(xì)胞越過(guò)G0/G1期，具有促進(jìn)NRK-52E細(xì)胞增殖的作用。分別在NRK-52E中加入PD098059（ERK抑制劑）、anisomycin（JNK、p38誘導(dǎo)劑）后，PD098059、anisomycin可在一定程度上對(duì)抗這種作用。③real time-PCR及Western blotting結(jié)果顯示H/R可增加cyclin D1、cyclin E的表達(dá)，這可能是一種損傷后啟動(dòng)修復(fù)的代償機(jī)制，而IMD可進(jìn)一步上調(diào)cyclin D1、cyclin E的表達(dá)，與對(duì)照組及H/R組相比具有顯著性差異（P0.05）；PD098059、anisomycin可在一定程度上對(duì)抗這一上調(diào)作用。④cyclinDl熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞的cyclin D1啟動(dòng)子活性增加，而IMD可進(jìn)一步上調(diào)cyclin D1啟動(dòng)子活性（與對(duì)照組相比，P＜0.05；與H/R組相比，P＜0.05）。PD098059（ERK抑制劑）、anisomycin（JNK、p38誘導(dǎo)劑）可在一定程度上對(duì)抗這一上調(diào)作用。提示IMD通過(guò)調(diào)控cyclin D1啟動(dòng)子的表達(dá)從而調(diào)控其表達(dá)。⑤EMSA結(jié)果顯示，IMD可增加AP-1位點(diǎn)的結(jié)合活性顯著上調(diào)，PD098059（ERK抑制劑）、anisomycin（JNK、p38誘導(dǎo)劑）可在一定程度上對(duì)抗這一上調(diào)作用。⑥免疫熒光檢測(cè)結(jié)果可見，cyclin D1呈紅色熒光，在NRK-52E細(xì)胞內(nèi)主要表達(dá)在細(xì)胞核中，DAPI呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，pIRES2-EGFP/IMD攜帶EGFP報(bào)告基因，呈現(xiàn)綠色熒光。 結(jié)論：在腎小管上皮細(xì)胞H/R模型中，IMD可以通過(guò)上調(diào)cyclin D1啟動(dòng)子活性及AP-1位點(diǎn)結(jié)合活性，增加cyclin D1、cyclin E蛋白表達(dá)，從而直接促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)腎組織IRI后細(xì)胞增殖和修復(fù)。而這一作用至少部分是通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

體外培養(yǎng)的正常 NRK-52E 細(xì)胞在倒置顯微鏡下，其形態(tài)呈“鵝卵石樣”鑲嵌排列，細(xì)胞扁平多角形狀，折光性良好，生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞之間接觸正常，緊密相靠，互相連接成片。細(xì)胞長(zhǎng)滿后呈接觸抑制現(xiàn)象。H/R 后細(xì)胞折光性減弱，細(xì)胞不再透亮而變得灰暗，懸浮細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，細(xì)胞之間接觸減少。見圖 1.1-1。正常細(xì)胞（光鏡×200） 正常細(xì)胞胰酶消化后（光鏡×200）ABCD

山西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文之間接觸減少。2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果H/R 處理可以導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞 NRK-52E 凋亡，與正常對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞凋亡率顯著增加，，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01；TM 處理組也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。（見表 1.1-2，圖 1.1-2，1.1-3）。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2694032