【摘要】：背景及意義：鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)感染引起的全球性流行人獸共患傳染病。盡管致病性鉤體血清群、型眾多,但我國(guó)流行最廣的致病性鉤體為問(wèn)號(hào)鉤體(Leptospira interrogans)黃疸出血群賴型。巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均能吞噬鉤體,但僅有巨噬細(xì)胞能殺滅吞噬的鉤體。我們以往研究發(fā)現(xiàn),問(wèn)號(hào)鉤體感染的人和小鼠巨噬細(xì)胞線粒體有明顯病變,但線粒體相關(guān)經(jīng)典的caspase9/3-細(xì)胞色素c凋亡信號(hào)通路未激活,故線粒體是否參與問(wèn)號(hào)鉤體感染性巨噬細(xì)胞凋亡有待于研究證實(shí)。我們推測(cè)問(wèn)號(hào)鉤體極有可能通過(guò)線粒體相關(guān)caspase非依賴凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)和核酸內(nèi)切酶G(endonuclease G,EndoG)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,研究結(jié)果有助于進(jìn)一步揭示問(wèn)號(hào)鉤體分子及細(xì)胞致病機(jī)制。 方法：建立問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株感染小鼠J774A.1巨噬細(xì)胞和人THP-1巨噬細(xì)胞模型。采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)感染前后細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)變化及DNA損傷情況。采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定感染前后細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)了解感染前后細(xì)胞周期調(diào)控以及凋亡相關(guān)基因mRNA水平變化。采用Western blot檢測(cè)感染前后細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及相關(guān)激酶磷酸化水平。采用siRNA沉默p53基因、抑制劑阻斷靶蛋白的方法,反向驗(yàn)證上述基因或靶蛋白在問(wèn)號(hào)鉤體感染性巨噬細(xì)胞周期阻滯及凋亡中的作用。 結(jié)果：?jiǎn)柼?hào)鉤體感染導(dǎo)致巨噬細(xì)胞ROS水平迅速升高,高濃度ROS引起細(xì)胞DNA損傷,表現(xiàn)為53BP1蛋白核內(nèi)聚集及H2AX蛋白磷酸化。DNA損傷使p53蛋白磷酸化激活并上調(diào)p21Cip1/WAF1基因表達(dá),Akt激酶去磷酸化導(dǎo)致P27Kip1基因表達(dá)上調(diào),p21Cip1/WAF1和p27Kip1蛋白共同引起細(xì)胞周期的迅速阻滯于G1期并出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。問(wèn)號(hào)鉤體感染過(guò)程中,人和小鼠巨噬細(xì)胞Bcl-2家族中促凋亡的Bax、Noxa、Puma蛋白表達(dá)上調(diào),抗凋亡的Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào),AIF和EndoG蛋白從線粒體釋放至胞漿中,Fas蛋白表達(dá)上調(diào)并加速募集于細(xì)胞膜。p53基因被沉默或p53信號(hào)通路被阻斷后,問(wèn)號(hào)鉤體感染引起的巨噬細(xì)胞G1期阻滯現(xiàn)象明顯減少、細(xì)胞凋亡率也顯著下降。 結(jié)論：?jiǎn)柼?hào)鉤體感染巨噬細(xì)胞后可導(dǎo)致胞內(nèi)ROS迅速升高及DNA損傷,DNA損傷激活的p53通過(guò)線粒體相關(guān)caspase非依賴p53-Bax/Noxa/Puma-AIF/EndoG信號(hào)通路導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的凋亡。 背景及意義：鉤端螺旋體病由致病性鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)感染引起的全球性流行人獸共患傳染病,我國(guó)也是鉤體病流行的主要疫區(qū)之一。接種疫苗是預(yù)防和控制鉤體病流行最為有效的措施。目前普遍使用的鉤體疫苗主要是根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍械臄?shù)種優(yōu)勢(shì)鉤體血清群、型制備的多價(jià)鉤體全菌死疫苗。然而,致病性鉤體血清群型眾多,不同地區(qū)主要流行的鉤體血清群型存在明顯差異；鉤體疫苗對(duì)其未包含的鉤體血清群、型無(wú)明顯的保護(hù)作用。此外,鉤體疫苗副作用較大,使該疫苗應(yīng)用受到很大限制。因此,研制對(duì)不同鉤體血清群型有交叉保護(hù)作用的高效無(wú)毒通用性鉤體新疫苗,對(duì)于鉤體病預(yù)防和控制具有重要意義。 方法：采用PCR擴(kuò)增我國(guó)流行的主要致病性問(wèn)號(hào)鉤體血清群型屬特異性外膜蛋白ligB、loa22、lipL32、groEL和lenA基因,T-A克隆后測(cè)序并比較其序列保守性。以問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組DNA為模板,用PCR擴(kuò)增上述基因并構(gòu)建其原核表達(dá)系統(tǒng)。采用SDS-PAGE聯(lián)合凝膠圖象分析系統(tǒng),檢查目的重組蛋白rLigB、rLoa22、rLipL32、rGroEL和rLenA表達(dá)情況及表達(dá)量。采用Ni-NTA親和層析法提純上述重組蛋白,免疫家兔制備相應(yīng)抗血清及其抗體。采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)LigB、Loa22、LipL32、GroEL和LenA中的T細(xì)胞和B細(xì)胞(T-B)聯(lián)合抗原表位。采用噬菌體展示系統(tǒng),制備含T-B聯(lián)合抗原表位的重組噬菌體PⅢ蛋白。采用Western blot和ELISA分別鑒定重組PⅢ蛋白中T-B聯(lián)合抗原表位和人工合成T-B聯(lián)合抗原表位肽的免疫反應(yīng)性。 結(jié)果：8群8型問(wèn)號(hào)鉤體均含ligB、loa22、lipL32和groEL基因,但僅有部分受檢問(wèn)號(hào)鉤體血清群型含lenA基因。上述基因氨基酸序列相似性分別為：ligB基因89.42%～98.63%、Ioa22基因92.82%～100%、lipL32基因98.53%～100%、groEL基因96.52%～100%。所構(gòu)建的各靶基因原核表達(dá)系統(tǒng)均能有效表達(dá)其重組蛋白。噬菌體展示及Western blot和ELISA結(jié)果顯示,LigB中LigB-371、LigB-744、 LigB-1528以及LipL32中LipL32-13、Loa22中Loa22-90、GroEL中GroEL-215是優(yōu)勢(shì)T-B聯(lián)合抗原表位。 結(jié)論：LigB、Loa22、LipL32和GroEL是問(wèn)號(hào)鉤體屬特異性外膜蛋白,其中LigB-371、LigB-744、LigB-1528、Loa22-90、LipL32-131、GroEL-215是優(yōu)勢(shì)T-B聯(lián)合抗原表位,可用于制備通用性問(wèn)號(hào)鉤體多抗原肽(multiple antigenic peptide, MAP)疫苗。 背景及意義：鉤端螺旋體病由致病性鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)感染引起的全球性流行人獸共患傳染病,但致病性鉤體感染過(guò)程中毒力基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制不明。RpoN,又稱Sigma54,是一種重要的原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,但敲除RpoN基因?qū)е裸^體死亡。與其他原核細(xì)胞Sigma因子不同,RpoN必須被轉(zhuǎn)錄激活因子——增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(enhancer binding protein, EBP)激活后才能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。迄今RpoN在多種細(xì)菌中被證實(shí)與氮代謝基因甚至毒力基因表達(dá)調(diào)控有關(guān),但RpoN在致病性鉤體中迄今未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究中,我們構(gòu)建了致病性問(wèn)號(hào)鉤體RpoN的EBP基因(fhlA)敲除突變株,通過(guò)突變株與野生株比較,間接了解RpoN對(duì)問(wèn)號(hào)鉤體生長(zhǎng)繁殖的影響及其調(diào)控的靶基因。 方法：采用生物信息學(xué)軟件并根據(jù)RpoN調(diào)控基因啟動(dòng)子序列特征,預(yù)測(cè)并分析了鉤端螺旋體基因組中RpoN、EBP編碼基因及其調(diào)控的靶基因。構(gòu)建RpoN基因原核表達(dá)系統(tǒng)并提純目的重組蛋白(rRpoN).采用凝膠遷移試驗(yàn)(gelelectrophoresis mobility shift assay, EMSA)篩選rRpoN調(diào)控的靶基因。采用隨機(jī)轉(zhuǎn)座突變法構(gòu)建問(wèn)號(hào)鉤體fhlA基因敲除突變株(ΔfhlA)。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR (qRT-PCR)檢測(cè)AfhlA突變株中候選靶基因nRNA水平變化。采用暗視野顯微鏡計(jì)數(shù)法測(cè)定突變株與野生株在不同pH或氮源條件下生長(zhǎng)曲線及菌株形態(tài)變化。采用Western blot法檢測(cè)突變株與野生株部分外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)表達(dá)情況。 結(jié)果：致病性問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株有一個(gè)RpoN基因和fhlA和atoC兩個(gè)EBP編碼基因以及15個(gè)含RpoN啟動(dòng)子序列的靶基因,非致病性雙曲鉤體三寶壟群Patoc型Patoc1株也有一個(gè)RpoN基因,但僅有一個(gè)EBP基因(fhlA) EMSA結(jié)果顯示,rRpoN可與lpxC(LA2306)、secE(LA3426)、glnA(LA1313)、 amtB(LA3806)以及LA1188、LA1968、LA2430、LA0773基因啟動(dòng)子序列結(jié)合。Δfh1A突變株LA1188、LA1968及amtB基因mRNA水平顯著下調(diào)(P0.05),其他靶基因mRNA水平無(wú)明顯變化。AfhlA突變株與野生株均可利用NH4Cl和谷氨酰胺作為氮源并正常繁殖,但在缺氮培養(yǎng)基中均不能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。AfhlA突變株有鉤體典型、活潑的運(yùn)動(dòng)方式,但外形變短(野生株21.7μm,突變株12.2μm)。Western blot結(jié)果顯示,受檢的5種OMP中,僅有OmpR表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：致病性鉤體RpoN信號(hào)通路較為復(fù)雜,可通過(guò)FhlA-RpoN或AtoC-RpoN途徑調(diào)控靶基因表達(dá)。有8個(gè)含RpoN啟動(dòng)子序列的基因能與RpoN結(jié)合,其中LA1188、LA1968、氮代謝相關(guān)amtB基因表達(dá)受Fh1A-RpoN通路調(diào)控。Fh1A-RpoN通路還能間接調(diào)控OmpR表達(dá)。
【圖文】：

結(jié)果顯示，NAC預(yù)處理J774A.1和THP-1細(xì)胞在感染0.5 h后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)入侵的病原菌體，0.5-8 h的感染過(guò)程中，ROS清除R嵲ご硐赴胛創(chuàng)硐赴啾任尷災(zāi)圓鉅臁 Time of infection (h)0.5 1 2 4 8J ■■■■■■■IHi!i ■■■■■■■■■■_■■■9

透射顯微鏡結(jié)果顯示鉤端螺旋體在感染ROS清除R嵲ご淼南赴輩⒉揮跋煜赴掏倥蕕男緯�，壤_，

本文編號(hào)：2693074