【摘要】：本部分介紹了一種新的隨機(jī)多肽文庫的構(gòu)建方法，，即用基因組DNA為原料來構(gòu)建隨機(jī)多肽文庫。 一般認(rèn)為，基因組DNA是不能夠直接用來表達(dá)出有生物學(xué)意義的蛋白質(zhì)或多肽。但是，如果我們需要的是隨機(jī)多肽，基因組DNA就可以被認(rèn)為是非常有用的資源。當(dāng)大的基因組DNA被僅識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生的短片段DNA可以近似的認(rèn)為是隨機(jī)序列的片段，這樣的短的隨機(jī)片段在本實(shí)驗(yàn)中被用來直接表達(dá)隨機(jī)多肽，成為隨機(jī)多肽文庫。例如人的基因組DNA為2.91×10~9bp，這樣大的基因組DNA經(jīng)識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶(DpnⅡ或Tsp509I)酶切后，因?yàn)檫@種酶在基因組上平均每隔256bp即有一個(gè)酶切位點(diǎn)，因此可以產(chǎn)生約10~7(2.91×10~9／256)個(gè)片段。由于每個(gè)片段的平均長度為256bp，所以這樣的片段可以編碼85個(gè)氨基酸(256／3)，又由于每64個(gè)密碼子當(dāng)中有3個(gè)終止密碼子，所以最后這樣的片段表達(dá)出的多肽的平均長度為21個(gè)氨基酸(64／3)。這些片段可以克隆到任何表達(dá)載體中。在這里我們將這些片段連接到用DpnⅡ(Tsp509I)的同尾酶BamHI(EcoRI)預(yù)先酶切的酵母雙雜交載體pGADT7上后，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌形成隨機(jī)多肽文庫。 在論文中，我們構(gòu)建了兩個(gè)這樣的隨機(jī)多肽文庫。一個(gè)是用DpnⅡ酶切人基因組DNA，所構(gòu)建的文庫的容量為1.1×10~6cfu。另一個(gè)是用Tsp509I酶切人基因組DNA，所構(gòu)建的文庫的容量為1.4×10~7cfu。
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R341

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本文編號(hào)：2685180