【摘要】： 本課題在“抗原定向選擇法”人源化鼠單抗的基礎上探討了一種新的人源化技術路線——CDR3導向抗體庫技術，對抗膀胱癌單抗BDI進行人源化。 首先通過RT-PCR方法從分泌抗膀胱癌單抗的雜交瘤細胞BDI中擴增鼠k鏈、Fd段基因，DNA序列測定表明分別屬于MκⅣ和MH3D亞群。將k鏈和Fd段基因克隆到噬菌體表達載體p3MH中，在大腸桿菌中獲得表達。通過PCR介導的定點突變，將Fd段N端的氨基酸序列矯正為親本鼠的原始序列，提高Fab的結合活性。運用ELISA、競爭抑制實驗、免疫組化實驗證實所獲Fab為BDI的Fab。 然后根據鼠單抗序列合成含鼠CDR3區(qū)的寡核苷酸引物，通過重疊PCR及DNA重組技術，將抗膀胱癌鼠單抗BDI的CDR3區(qū)與人淋巴細胞來源的多樣化的VH和VL組合，構建含BDI CDR3的初級人源噬菌體抗體庫，庫容為2×10~7；利用loxp-cre定位重組系統，經過在cre~+ BS1365細菌胞內的定位重組后，增加輕重鏈的組合配對，最終獲得容量為1×10~(10)大容量次級噬菌體抗體庫。用膀胱癌細胞(EJ)進行四輪的吸附-洗脫-擴增，挑選第四輪篩選后的46個克隆進行ELISA檢測，，獲得4個能夠與EJ細胞特異結合的克隆。競爭抑制實驗顯示，其中3個與親本鼠單抗識別相同的抗原表位。測定其可變區(qū)基因的序列，VH分別屬VHⅠ、VHⅡ亞群，Vk屬VkⅠ、VkⅥ亞群。選擇活性較高的克隆進行膀胱癌組織的免疫組化實驗，顯示該克隆能夠與癌組織特異性結合。 本研究通過鼠CDR3對人抗體庫的限定，使所獲抗體庫具有預定的偏向性，有利于特定抗體的篩選。同時將loxp-cre重組系統引入噬菌體抗體庫中，構建大容量抗體庫。不用鼠單抗做模板進行鏈替換，獲得了與鼠單抗識別相同表位的人源抗體。
【圖文】：

圖2.PCR擴增雜交瘤BDI抗體基因M:DNAmarker(DLZOOO)2.K鏈基因擴增產物4.Fd段基因擴增產克隆至pGEM一T載體，電轉化XL卜Blue菌，選初步鑒定可能有重組的克隆中，各挑(圖3)，以Sac工+Xbal鑒定K鏈，以Xhol+SGEM一K經Sac工+Xba工雙酶切后產生300Obp明有K鏈的重組;以XhO工+Spe工雙酶切

圖3.重組質粒的酶切鑒定M:DNAmarker(DL1500O)EM載體的酶切(SaCI+Xbal)產物:3，4+Spel)產物.因序列的測定各取2個克隆送北京伯博亞公司測序，2區(qū)基因。結果與Kabat免疫球蛋白基因數重鏈分別屬于MKry和MH3D亞群(圖4)。TCGTCATGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGVMTQ5PA1M5A5LGTGCACTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCACTTACTTGCACTG
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R392.11

【參考文獻】

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1 李競,王琰,王卓智,劉群英,化冰,陳宇萍,朱迎春,董志偉;抗胃癌單抗3H11可變區(qū)氨基端序列對抗體活性的影響[J];生物化學與生物物理進展;1999年04期

2 王琰,王剛,化冰;人噬菌體抗體庫中異常重組子的分析[J];細胞與分子免疫學雜志;2002年01期

3 布卡,俞莉章,張春麗,謝蜀生,朱紹莉,潘中允,郭應祿,顧方六;抗人膀胱癌單克隆抗體的~（99m）Tc標記及荷瘤裸鼠放射免疫顯像[J];中華外科雜志;1996年01期

4 王卓智,王琰,李競,劉群英,化冰,陳宇萍,朱迎春,李振甫,董志偉;用抗原表位定向選擇方法人源化抗TNF-α抗體Fab段[J];中華微生物學和免疫學雜志;1998年06期

5 王琰,化冰,劉群英,陳宇萍,朱迎春;半合成抗體庫的構建及鑒定[J];中華微生物學和免疫學雜志;1999年03期

6 王琰,王欲曉,陳曉穗,化冰,劉曉琳;用于大容量噬菌體抗體庫的表達載體的構建及鑒定[J];中國免疫學雜志;2003年02期

本文編號：2677296