【摘要】： 本課題在“抗原定向選擇法”人源化鼠單抗的基礎(chǔ)上探討了一種新的人源化技術(shù)路線——CDR3導(dǎo)向抗體庫技術(shù)，對(duì)抗膀胱癌單抗BDI進(jìn)行人源化。 首先通過RT-PCR方法從分泌抗膀胱癌單抗的雜交瘤細(xì)胞BDI中擴(kuò)增鼠k鏈、Fd段基因，DNA序列測(cè)定表明分別屬于MκⅣ和MH3D亞群。將k鏈和Fd段基因克隆到噬菌體表達(dá)載體p3MH中，在大腸桿菌中獲得表達(dá)。通過PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變，將Fd段N端的氨基酸序列矯正為親本鼠的原始序列，提高Fab的結(jié)合活性。運(yùn)用ELISA、競爭抑制實(shí)驗(yàn)、免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)所獲Fab為BDI的Fab。 然后根據(jù)鼠單抗序列合成含鼠CDR3區(qū)的寡核苷酸引物，通過重疊PCR及DNA重組技術(shù)，將抗膀胱癌鼠單抗BDI的CDR3區(qū)與人淋巴細(xì)胞來源的多樣化的VH和VL組合，構(gòu)建含BDI CDR3的初級(jí)人源噬菌體抗體庫，庫容為2×10~7；利用loxp-cre定位重組系統(tǒng)，經(jīng)過在cre~+ BS1365細(xì)菌胞內(nèi)的定位重組后，增加輕重鏈的組合配對(duì)，最終獲得容量為1×10~(10)大容量次級(jí)噬菌體抗體庫。用膀胱癌細(xì)胞(EJ)進(jìn)行四輪的吸附-洗脫-擴(kuò)增，挑選第四輪篩選后的46個(gè)克隆進(jìn)行ELISA檢測(cè)，，獲得4個(gè)能夠與EJ細(xì)胞特異結(jié)合的克隆。競爭抑制實(shí)驗(yàn)顯示，其中3個(gè)與親本鼠單抗識(shí)別相同的抗原表位。測(cè)定其可變區(qū)基因的序列，VH分別屬VHⅠ、VHⅡ亞群，Vk屬VkⅠ、VkⅥ亞群。選擇活性較高的克隆進(jìn)行膀胱癌組織的免疫組化實(shí)驗(yàn)，顯示該克隆能夠與癌組織特異性結(jié)合。 本研究通過鼠CDR3對(duì)人抗體庫的限定，使所獲抗體庫具有預(yù)定的偏向性，有利于特定抗體的篩選。同時(shí)將loxp-cre重組系統(tǒng)引入噬菌體抗體庫中，構(gòu)建大容量抗體庫。不用鼠單抗做模板進(jìn)行鏈替換，獲得了與鼠單抗識(shí)別相同表位的人源抗體。
【圖文】：

圖2.PCR擴(kuò)增雜交瘤BDI抗體基因M:DNAmarker(DLZOOO)2.K鏈基因擴(kuò)增產(chǎn)物4.Fd段基因擴(kuò)增產(chǎn)克隆至pGEM一T載體，電轉(zhuǎn)化XL卜Blue菌，選初步鑒定可能有重組的克隆中，各挑(圖3)，以Sac工+Xbal鑒定K鏈，以Xhol+SGEM一K經(jīng)Sac工+Xba工雙酶切后產(chǎn)生300Obp明有K鏈的重組;以XhO工+Spe工雙酶切

圖3.重組質(zhì)粒的酶切鑒定M:DNAmarker(DL1500O)EM載體的酶切(SaCI+Xbal)產(chǎn)物:3，4+Spel)產(chǎn)物.因序列的測(cè)定各取2個(gè)克隆送北京伯博亞公司測(cè)序，2區(qū)基因。結(jié)果與Kabat免疫球蛋白基因數(shù)重鏈分別屬于MKry和MH3D亞群(圖4)。TCGTCATGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGVMTQ5PA1M5A5LGTGCACTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCACTTACTTGCACTG
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392.11

【參考文獻(xiàn)】

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1 李競,王琰,王卓智,劉群英,化冰,陳宇萍,朱迎春,董志偉;抗胃癌單抗3H11可變區(qū)氨基端序列對(duì)抗體活性的影響[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1999年04期

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4 王卓智,王琰,李競,劉群英,化冰,陳宇萍,朱迎春,李振甫,董志偉;用抗原表位定向選擇方法人源化抗TNF-α抗體Fab段[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1998年06期

5 王琰,化冰,劉群英,陳宇萍,朱迎春;半合成抗體庫的構(gòu)建及鑒定[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1999年03期

6 王琰,王欲曉,陳曉穗,化冰,劉曉琳;用于大容量噬菌體抗體庫的表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定[J];中國免疫學(xué)雜志;2003年02期

本文編號(hào)：2677296