【摘要】：研究目的：anti-HCV檢測對于控制HCV經(jīng)輸血傳播，及時診斷HCV感染患者發(fā)揮了巨大的作用。目前所用第三代ELISA檢測試劑較早期試劑在靈敏度和特異性上都有了很大提高，但在檢測低感染率(＜10％)人群時特異性仍不理想，陽性結(jié)果人群中約35％(15％－60％)為假陽性，在獻血員中陽性結(jié)果的預(yù)示值僅為70－80％，造成了醫(yī)療資源和寶貴血源的很大浪費。雙抗原夾心法在方法學上比目前所用間接法特異性更好，靈敏度更高，本研究旨在建立雙抗原夾心anti－HCV ELISA檢測方法，以解決間接法特異性不足問題。 研究內(nèi)容： 1．多表位融合重組HCV抗原基因的克隆與序列分析 選擇HCV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白優(yōu)勢抗原表位的編碼基因，以及來自HCV不同病毒型別的抗原表位編碼基因共12個，拼接成長度為1450bp的嵌合抗原編碼序列，插入pQE-30和pinpoint T表達載體，分別轉(zhuǎn)入M15和JM109(DE3)工程菌，應(yīng)用PCR擴增和測序證實插入序列具有正確的編碼序列和正確閱讀框架。 2．多表位融合重組HCV抗原的表達、純化與活性鑒定 將M15和／M109(DE3)工程菌誘導表達顯示，融合蛋白在M15中以包涵體形式表達，帶有6×組氨酸標簽；在JM109中可溶性表達，氨基端帶有生物素化的標簽。表達蛋白經(jīng)親和純化后分別測定各抗原表位的分片段抗原性和生物素標簽的親和素結(jié)合活性。結(jié)果表明重組蛋白抗原性完整，可以用于anti-HCV的檢測；生物素標簽具有良好的親和素結(jié)合活性，可用作ELISA檢測的信號放大系統(tǒng)。 博士學位論文:多表位觸合HCV抗原的構(gòu)建與雙抗原夾心檢測anti一HCV可行性研究 3.Anti一HCv雙抗原夾心EL工SA法的建立及效果評價 用His一tagged一HCV抗原包被酶聯(lián)板，以可溶性表達的biotin一tagged一HCV作 為夾心抗原，Str即tav 1 d in一HRP用作顯色用酶標記物建立了雙抗原夾心法。 結(jié)果顯示，方法具有極好的特異性，400份陰性血清無一例假陽性; 接法檢測陽性的標本中，有12份標本雙抗原夾心法檢測陰性，這 RT一PCR及RIBA確證試驗均為陰性。 結(jié)論:目前anti一HCV的檢測國內(nèi)外均只有間接ELISA法，本文選取 臨床350 應(yīng)用 份間 12份標本經(jīng) 優(yōu)勢表位和不同型別抗原表位， 抗原去除了與檢測無關(guān)的序列， 構(gòu)建了多表位融合重組HCv抗原。 HCV各抗原的 優(yōu)勢表位融合 避免了非特異反應(yīng)的發(fā)生;同時由于兼顧了不同 HCV型別差異，也會使檢出率有所提高。帶有生物素標簽的融合抗原克服了分片段 抗原聯(lián)合應(yīng)用時難以掌握配比及酶標記對抗原活性影響等難題，使雙抗原夾心檢 測anti一HCV得以實現(xiàn)。本研究所建立的雙抗原夾心ELISA檢測法的特異性遠高于 目前廣泛使用的間接法，雙抗原夾心法能同時檢測IgG、IgM和工gA抗體，提高了 檢出率，應(yīng)用Biotin--avidin這一成熟穩(wěn)定的信號放大系統(tǒng)提高了方法靈敏度。如 用于anti一HCV篩查，可以顯著降低寶貴血源的浪費，并減少臨床誤診率，節(jié)約醫(yī) 療資源:并有可能代替昂貴復雜的RIBA，成為簡便易行的anti一HCV確證試驗。
【圖文】：

博士學位論文:多表位融合HCv抗原的構(gòu)建與雙抗原夾心檢測anti一HCv可行性HCV也是診斷丙型肝炎患者的有效手段。最初僅使用單一的克隆表達HC蛋白C一100包被酶聯(lián)板檢測相應(yīng)的抗體，該方法存在的問題是:①抗一C100較晚，直到肝炎發(fā)生15周后才能檢出NS4抗體。②靈敏度不高，少數(shù)病到針對非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原C一100的抗體，會造成一定數(shù)量的漏檢。③特異性差自身免疫性慢性肝炎患者可出現(xiàn)假陽性，因而陽性結(jié)果需要重組免疫印跡ReeombinantxmmunoboltAssay，班BA)證實[3]。第二代EIA試劑引入了組抗原，包括C22一3(Core)，C33e(N53)，C100一3伽54)。第三代又增加了N，多種抗原的同時應(yīng)用提高了檢測的敏感性。隨著EIA試劑的改進，檢測不斷縮短，l，2，3代檢測試劑窗口期分別為16、10、7一8周，靈敏度的提益于對核心和NS3的改造，NSS抗原的應(yīng)用對靈敏度無明顯影響〔j·污，。一、EUSA檢測試劑所用抗原區(qū)別如圖2所示:

經(jīng)文獻調(diào)研和DNAstar等生物學軟件分析，選擇分布于HCV各抗原的優(yōu)勢表位編碼序列共12個，，分別來自于Core、EZ、NS3、NS4和NSS，它們在HCV多蛋白前體上的位置如圖1.1所示。圖1.1所選優(yōu)勢抗原表位與HCV多蛋白前體的對應(yīng)關(guān)系考慮到HCV中國流行株與國外的差異，為使融合抗原更能代表HCV國內(nèi)感染株的實際情況，避免因直接簡單采用國外報道序列所引起的因序列差異而產(chǎn)生漏檢，本研究針對性地選擇Genebank中的D10934、L02836和D00944的序列，分別分離自北京、河北和日本病人[’，2l。序列的來源及其在嵌合抗原上的位置如圖1.2所示。D10934序列的7224一7280bP7513一754lbPD00944序列的6112一6182bPL02836.1的5341一558IbPLLL02836.l的的444045一4269bPPP444416一4710bPPPL02836.1的1744一1847bP1981一2046bP2077一Z139bPD10934序列的654一695bP341一458bPD00944序列的530一580bP圖1
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李保昌,孫萍,楊淑華,王全立;生物素化HCV多抗原表位融合基因的克隆及可溶性表達[J];中國實驗血液學雜志;2004年03期

本文編號：2672516