【摘要】： 目的：構建弓形蟲昆山分離株和RH株速殖子期表達的基因的完整長度 cDNA文庫，從中篩選保護性抗原基因，導入乳酸乳球菌進行表達，制備 弓形蟲口服基因疫苗，免疫小鼠，觀察其抗攻擊感染的保護力。方法：用 CF-11纖維素柱快速提純速殖子，以鹽酸異硫氰酸胍（AGPC）一步法抽 提總RNA，，oligo-dT纖維素分離mRNA后，用ClonTech公司的Smart~(TM) PCR cDNA文庫構建試劑盒，構建了弓形蟲昆山分離株和RH株的表達型 文庫。采用聚合酶鏈反應（PCR）從cDNA文庫中擴增得到編碼P30和 ROP1的基因，經DNA序列分析后導入表達載體pGEX-5x-3，然后在大 腸桿菌BL21中進行表達。用親和層析柱純化表達產物，并以SDS-PAGE 和Western blotting進行鑒定。從構建好的質粒psk-P30中以BamHI和XhoⅠ 雙酶切出P30基因，以相同的酶切位點導入psk-PsT質粒，再以PvuⅡ將 Ps-P30-T切出，以相同的酶切位點導入大腸桿菌-等酸乳球菌穿梭表達質 粒L2-PTRK而構建成L2-PsP30T質粒。用BamHI和XhoⅠ從構建好的 psk-ROP1中切出ROP1再以相同的酶切位點導入L2-PsP30T而構建成 L2-PsROP1T。電轉化感受態(tài)乳酸乳球菌，以Western blotting分別鑒定P30 和ROP1在乳酸乳球菌中的表達。大量發(fā)酵制備口服疫苗，并且通過口服 方法免疫BALB/c小鼠。經過4周7次口服后，用約100個弓形蟲RH 株速殖子攻擊感染已經口服法免疫的BALB/c小鼠，觀察其抗攻擊感染的 保護力，并檢測細胞因子IL-4、INF-γ水平的動態(tài)變化。結果：1.構建 成弓形蟲昆山分離株和國際標準株RH株cDNA文庫，分別獲得5×10~6 （昆山分離株）和5×10~5（RH株）個獨立克隆，重組率均為99％，插入 片段的平均長度均約為1kb。2.獲得弓形蟲昆山分離株的P30基因和RH 株的ROP1基因，并證明昆山分離株的P30基因與RH株的P30基因之 間只有兩個堿基不同。我們得到的RH株的ROP1基因在Ossorio報道的 基因的447位與448位之間有一96bp的插入片段，另有14個堿基不同， 造成3個氨基酸的改變。兩基因之間有91.19％的同源性。3.在大腸桿菌 乳臣扎球苗表達口用弓形蟲基因疫苗的研究 中文摘要 表達P30基因時得到一分子量為54ica的融合蛋白，占大腸桿菌總蛋白 的38％。在大腸桿菌表達MI基因時得到一分子量約為7IkDa的融 合蛋白。4．P3 0 ＄因和ROPI基因在乳酸乳球菌中的表達產物中分別有一 約30ica、43 ica的蛋白帶能被弓形蟲病人血清識別 5．P30組其平均 壽命為 14．25天，ROPI組其平均壽命 7．75天，P30加 ROPI組其平均壽 命7．5天，空質粒對照組為8．5天，生理鹽水對照組為8天。與對照組 相比，免疫組的eF4的水平升高，而h4的水平降低。結論：l本文庫 可望用于弓形蟲疫苗研究的候選基因的篩選。2．得了一與OSS。i。報道的 基因有較大差異的ROP基因。3分別在大腸桿菌中得到了P30融合蛋 白和ROPI融合蛋白的高效表達。4．在乳酸乳球菌中得到了P30蛋白和 ROP蛋白的微量表達。5．通過口服法進行乳酸乳球菌活菌表達的弓形蟲 基因疫苗免疫是一種有希望的抵抗弓形蟲的方法。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2001
【分類號】：R392-33

【引證文獻】

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1 張鳳珍;李景峰;;弓形蟲疫苗研究進展[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2010年07期

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1 楊莉莉;剛第弓形蟲（Toxoplasma gondii）PCR診斷方法的建立與NTA致弱株安全性及免疫效力研究[D];南京農業(yè)大學;2006年

2 茍惠天;弓形蟲GJS株微線體蛋白3基因的克隆、表達及鑒定[D];甘肅農業(yè)大學;2008年

本文編號：2629591