【摘要】： 目的：構(gòu)建弓形蟲昆山分離株和RH株速殖子期表達(dá)的基因的完整長度 cDNA文庫，從中篩選保護(hù)性抗原基因，導(dǎo)入乳酸乳球菌進(jìn)行表達(dá)，制備 弓形蟲口服基因疫苗，免疫小鼠，觀察其抗攻擊感染的保護(hù)力。方法：用 CF-11纖維素柱快速提純速殖子，以鹽酸異硫氰酸胍（AGPC）一步法抽 提總RNA，，oligo-dT纖維素分離mRNA后，用ClonTech公司的Smart~(TM) PCR cDNA文庫構(gòu)建試劑盒，構(gòu)建了弓形蟲昆山分離株和RH株的表達(dá)型 文庫。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）從cDNA文庫中擴(kuò)增得到編碼P30和 ROP1的基因，經(jīng)DNA序列分析后導(dǎo)入表達(dá)載體pGEX-5x-3，然后在大 腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)。用親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物，并以SDS-PAGE 和Western blotting進(jìn)行鑒定。從構(gòu)建好的質(zhì)粒psk-P30中以BamHI和XhoⅠ 雙酶切出P30基因，以相同的酶切位點導(dǎo)入psk-PsT質(zhì)粒，再以PvuⅡ?qū)?Ps-P30-T切出，以相同的酶切位點導(dǎo)入大腸桿菌-等酸乳球菌穿梭表達(dá)質(zhì) 粒L2-PTRK而構(gòu)建成L2-PsP30T質(zhì)粒。用BamHI和XhoⅠ從構(gòu)建好的 psk-ROP1中切出ROP1再以相同的酶切位點導(dǎo)入L2-PsP30T而構(gòu)建成 L2-PsROP1T。電轉(zhuǎn)化感受態(tài)乳酸乳球菌，以Western blotting分別鑒定P30 和ROP1在乳酸乳球菌中的表達(dá)。大量發(fā)酵制備口服疫苗，并且通過口服 方法免疫BALB/c小鼠。經(jīng)過4周7次口服后，用約100個弓形蟲RH 株速殖子攻擊感染已經(jīng)口服法免疫的BALB/c小鼠，觀察其抗攻擊感染的 保護(hù)力，并檢測細(xì)胞因子IL-4、INF-γ水平的動態(tài)變化。結(jié)果：1.構(gòu)建 成弓形蟲昆山分離株和國際標(biāo)準(zhǔn)株RH株cDNA文庫，分別獲得5×10~6 （昆山分離株）和5×10~5（RH株）個獨立克隆，重組率均為99％，插入 片段的平均長度均約為1kb。2.獲得弓形蟲昆山分離株的P30基因和RH 株的ROP1基因，并證明昆山分離株的P30基因與RH株的P30基因之 間只有兩個堿基不同。我們得到的RH株的ROP1基因在Ossorio報道的 基因的447位與448位之間有一96bp的插入片段，另有14個堿基不同， 造成3個氨基酸的改變。兩基因之間有91.19％的同源性。3.在大腸桿菌 乳臣扎球苗表達(dá)口用弓形蟲基因疫苗的研究 中文摘要 表達(dá)P30基因時得到一分子量為54ica的融合蛋白，占大腸桿菌總蛋白 的38％。在大腸桿菌表達(dá)MI基因時得到一分子量約為7IkDa的融 合蛋白。4．P3 0 ＄因和ROPI基因在乳酸乳球菌中的表達(dá)產(chǎn)物中分別有一 約30ica、43 ica的蛋白帶能被弓形蟲病人血清識別 5．P30組其平均 壽命為 14．25天，ROPI組其平均壽命 7．75天，P30加 ROPI組其平均壽 命7．5天，空質(zhì)粒對照組為8．5天，生理鹽水對照組為8天。與對照組 相比，免疫組的eF4的水平升高，而h4的水平降低。結(jié)論：l本文庫 可望用于弓形蟲疫苗研究的候選基因的篩選。2．得了一與OSS。i。報道的 基因有較大差異的ROP基因。3分別在大腸桿菌中得到了P30融合蛋 白和ROPI融合蛋白的高效表達(dá)。4．在乳酸乳球菌中得到了P30蛋白和 ROP蛋白的微量表達(dá)。5．通過口服法進(jìn)行乳酸乳球菌活菌表達(dá)的弓形蟲 基因疫苗免疫是一種有希望的抵抗弓形蟲的方法。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：R392-33

【引證文獻(xiàn)】

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2 茍惠天;弓形蟲GJS株微線體蛋白3基因的克隆、表達(dá)及鑒定[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

本文編號：2629591