【摘要】： 周期蛋白依賴性激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)作為一種重要的周期蛋白,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者的預后密切相關,并在多種腫瘤中存在著過度表達和活化。通過反義核酸、導入抗體和降解腫瘤細胞內CDK4蛋白均能阻礙腫瘤細胞的增殖,因此CDK4被認為是腫瘤治療的重要靶點。 胞內抗體技術(intrcellular antibody or intrabody)通過基因重組技術在細胞內表達抗體分子,并被定位于特定的亞細胞器中,能夠特異性地結合細胞內靶分子,進而影響靶分子的加工或分泌及其生物學效應,從而實現(xiàn)特定基因表型敲除,成為一種新興的基因治療方法。但由于以往的研究中體外篩選的胞內抗體在真核細胞內環(huán)境下常出現(xiàn)不穩(wěn)定和可溶性降低等現(xiàn)象,抑制了其功能的有效發(fā)揮。胞內抗體捕獲技術(intracellular antibodies capture technology, IACT)是一種在高通量篩選的基礎上,有效分離具有抗原特異性,并可在真核細胞內穩(wěn)定、可溶表達的胞內抗體篩選技術。 為了制備高效抗CDK4胞內抗體,有效的滅活腫瘤細胞內過度活化的CDK4活性,抑制腫瘤細胞的增殖,本實驗通過IACT方法將經過兩輪CDK4抗原篩選富集的噬菌體單鏈抗體基因文庫同源重組或連接克隆至酵母表達載體中,獲得酵母人源單鏈抗體文庫。并通過酵母雙雜交技術共篩選得到25個陽性抗體克隆。 本實驗得到的結果對后續(xù)開展抗CDK4胞內抗體腫瘤基因治療的研究奠定了基礎。
【圖文】：

重組質粒pGBKT7-CDK4的構建流程

瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，在 T4 DNA 連接酶的作用下與載體片段連接，連接產物轉化大腸桿菌 DH5α，提取陽性克隆質粒進行 EcoRI 和 SalI 酶切鑒定分析。瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，在7300 bp和910 bp處分別出現(xiàn)明顯的DNA條帶（圖3.2），與實驗設計基本一致，初步確定 pGBKT7-CDK4 重組質粒構建成功。進一步通過 T 7 Promoter 和 T 7 Terminator 通用引物正反向測序 pGBKT7-CDK4 上的目的片段，測序結果表明，插入序列與實驗設計一致，并且讀碼框完全正確，共 912bp，表達 303 個氨基酸，分子量大約 33.73 kD。3.1.2 pGBKT7-CDK4 的酵母轉化為了進行后續(xù)酵母雙雜交實驗及其 IACT 篩選，首先將重組質粒pGBKT7-CDK4 轉化酵母 Y187，涂布于 SD/-Trp 培養(yǎng)板上
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2583624