【摘要】：目的建立Vero細(xì)胞腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗的純化工藝。方法病毒收獲液經(jīng)離心澄清、福爾馬林滅活和超濾濃縮后,采用Sephacryl S-400 HR凝膠過濾層析和Source 30Q離子交換層析2步層析法純化EV71,進(jìn)行各項(xiàng)檢定及分析后除菌過濾。結(jié)果經(jīng)純化的疫苗各項(xiàng)純化指標(biāo)均符合中國(guó)藥典2010年版的要求,雜蛋白去除率99.9%;病毒純化液在電鏡下觀察到典型的EV71病毒顆粒,經(jīng)SDS-PAGE及Western blot分析,檢測(cè)到與文獻(xiàn)報(bào)道大小相符的EV71 VP1、VP2、VP3及特異性免疫反應(yīng);制備成疫苗后免疫大鼠能產(chǎn)生特異性中和抗體。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)建立了Vero細(xì)胞的EV71滅活疫苗的純化工藝,純化后制備的EV71滅活疫苗具有較好的免疫原性。
【圖文】：

n’tproducespecificCPE.3.2抗原含量、蛋白含量和各項(xiàng)殘留檢測(cè)以及雜蛋白去除率分析病毒液經(jīng)SephacrylS-400HR柱純化后，病毒抗原和其他雜質(zhì)獲得了較好的分離，病毒抗原主要集中在第2峰(病毒峰)；再經(jīng)Source30Q柱純化，進(jìn)一步去除了宿主DNA及其他微量的殘留，第1峰(病毒峰)為目的抗原，結(jié)果見圖1。純化后的病毒液進(jìn)行抗原含量、游離甲醛殘留、BSA殘留、Vero細(xì)胞HCP殘留、Vero細(xì)胞DNA殘留、內(nèi)毒素含量檢測(cè)，結(jié)果見表2。根據(jù)對(duì)病毒收獲液和病毒純化液的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，計(jì)算出雜蛋白去除率均>99.9%，結(jié)果見表3。圖1EV71疫苗的柱層析圖譜ASephacrylS-400HR柱；BSource30Q柱。Fig.1ChromatographicprofileofEV71vaccineASephacrylS-400HR;BSource30Q.

DNA殘留/pg·mL1內(nèi)毒素含量/EU·mL1201003512001324.8323<10<10201004512002530.0155<100<10201005512002128.776<100<10表3病毒液純化后的雜蛋白去除率Tab.3Theremovalratesofforeignproteininvirusbulkafterpurification批號(hào)病毒收獲液病毒純化液雜蛋白去除率/%體積/L蛋白含量/μg·mL1體積/L蛋白含量/μg·mL1201003202106.60.6857.799.91201004201879.40.6544.099.93201005201984.10.7040.499.923.3HPLC檢測(cè)純化后的病毒抗原經(jīng)HPLC測(cè)定，純度>95%，結(jié)果見圖2。圖2EV71純化產(chǎn)物的HPLC純度測(cè)定Fig.2PuritytestingofpurifiedEV71byHPLC3.4SDS-PAGE及Westernblot分析SDS-PAGE分析結(jié)果顯示經(jīng)SephacrylS-400HR和Source30Q純化后的病毒產(chǎn)物，純度得到了顯著提高，并觀察到與EV71病毒特異性結(jié)構(gòu)蛋白條帶VP1、VP2和VP3理論分子量大小的3條條帶，結(jié)果見圖3A和B。病毒純化產(chǎn)物用EV71特異性鼠單抗進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果呈陽(yáng)性，結(jié)果見圖3C。圖3EV71純化產(chǎn)物SDS-PAGE及Westernblot分析ASephacrylS-400HR純化產(chǎn)物；BSource30Q純化產(chǎn)物；CEV71疫苗純化產(chǎn)物。Fig.3SDS-PAGEandWesternblotanalysisofpurifiedEV71ASephacrylS-400HRchromatographyproducts;BSource30Qchromatographyproducts;CpurifiedEV71vaccine.3.5電鏡觀察結(jié)果純化后的樣品進(jìn)行透射電鏡觀察，在放大倍數(shù)為2~10萬(wàn)倍時(shí)能看到病毒顆粒，病毒顆粒呈球形，大小比較均一，直徑約為27nm，，符合典型的EV71特征，結(jié)果見圖4。圖4EV71純化樣品的透射電鏡圖(93000×)Fig.4ElectromicroscopyofpurifiedEV71(93000×)3.6免疫原性檢測(cè)血清自1∶2開始2倍系列稀釋檢測(cè)中和抗體，首次免疫后2周，血清中出現(xiàn)少量EV71中和抗?

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2580955