【摘要】： 目的 通過將乙肝表面抗原和CpG-ODN單獨或聯(lián)合免疫BAL b/c小鼠,觀察小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平及其脾臟的組織形態(tài)學(xué)改變,評價CpG-ODN在小鼠全身和脾臟局部產(chǎn)生的免疫學(xué)效應(yīng),探討CpG-ODN的免疫增強功能和可能的安全性問題;并進一步體外觀察經(jīng)乙肝表面抗原與CpG-ODN單獨或聯(lián)合體外刺激后小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性的動態(tài)改變,評價CpG-ODN對乙肝表面抗原的免疫增強功能,進而探討CpG-ODN是否可以作為乙肝表面抗原的免疫佐劑。 方法 將CpG-ODN質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,涂布于氨芐平板37℃培養(yǎng),挑取若干菌落于37℃小量液體培養(yǎng),堿裂解法抽提質(zhì)粒,酶切電泳鑒定;將鑒定成功菌落擴大培養(yǎng),用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,紫外分光光度法鑒定質(zhì)粒的含量和純度。BAL b/c小鼠隨機分成五組:HBsAg和高劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg與CpG-ODN中劑量組、HBsAg和低劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg單用組和生理鹽水對照組,分別于第0、2、4周免疫BAL b/c小鼠。于第1-8周斷尾采血,ELISA法檢測小鼠外周血中HBsAb和IFN-γ的水平;于第9周取脾,分離小鼠脾淋巴細(xì)胞,并分別用ConA和HBsAg體外刺激培養(yǎng)24h,XTT/PMS法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性;同時制備小鼠脾臟組織的石蠟切片,HE染色法觀察小鼠脾臟組織形態(tài)學(xué)改變。通過設(shè)立ConA組、HBsAg組、HBsAg與CpG-ODN聯(lián)用組、HBsAg與pUC18聯(lián)用組、CpG-ODN組、pUC18組、細(xì)胞空白對照及培養(yǎng)基空白對照組, XTT/PMS法評價HBsAg和/或CpG ODN對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果 CpG-ODN質(zhì)粒的含量為3.75mg,OD260/OD280比值為1.77。HBsAg和高劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg和中劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg和低劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組的HBsAb水平均顯著高于HBsAg單用組(p0.05);HBsAg和高劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg和中劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組的IFN-γ水平和脾淋巴細(xì)胞增殖活性均顯著高于HBsAg單用組和生理鹽水對照組(p0.05)。HE染色提示,與HBsAg單用組和生理鹽水對照組相比,HBsAg和高劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg和中劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組、HBsAg和低劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組的小鼠脾臟的白髓、紅髓界限清晰,白髓中的動脈周圍淋巴鞘增厚,脾小體數(shù)量增多,體積增大,脾小體可見明顯的生發(fā)中心;紅髓充血明顯,脾索和脾血竇界限模糊。相對而言,HBsAg和CpG-ODN高、中劑量組的小鼠脾臟的動脈周圍淋巴鞘較厚,脾小體體積較大,而HBsAg和低劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組小鼠脾臟紅髓充血較為明顯。HBsAg和高劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫組的小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)尚清晰完整,未觀察到脾小體結(jié)構(gòu)形態(tài)的異常。XTT/PMS檢測發(fā)現(xiàn),CpG-ODN最適終濃度是5-10μg/mL;最適刺激培養(yǎng)時間為72h。 結(jié)論 CpG-ODN可以明顯地提高小鼠產(chǎn)生針對乙肝表面抗原的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平;高劑量的CpG-ODN沖擊并未誘發(fā)小鼠脾臟產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫損傷;CpG-ODN能夠顯著增強HBsAg對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的刺激作用,可以作為乙肝表面抗原有效的免疫佐劑。
【圖文】：

)；無論ConA或HBsAg刺激，HBsAg和中劑量CpG-ODN聯(lián)合免疫 CpG-ODN 聯(lián)合免疫組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。經(jīng) ConA低劑量 CpG-ODN 聯(lián)合免疫組的淋巴細(xì)胞增殖活性與 HBsAg 單用組之間相比均有顯著性差異(p<0.05)，而 HBsAg 單用組和生理鹽水學(xué)差異(p>0.05)；經(jīng) HBsAg 刺激后，，HBsAg 和低劑量 CpG-ODN 聯(lián)用組與生理鹽水對照組之間的淋巴細(xì)胞增殖活性，兩兩比較均無統(tǒng)脾臟組織形態(tài)學(xué)觀察觀察小鼠脾臟組織形態(tài)學(xué)改變?nèi)缦拢?

圖 2.6 HBsAg 和中劑量 CpG-ODN 聯(lián)合免疫組小鼠脾臟 HE 染色(10X)注：CA：中央動脈；PLS：動脈周圍淋巴鞘；SC：脾小體；RP：紅髓atoxylin-eosin staining of spleens of mice immunized with HBsAg and the mof CpG-ODN (10X)A: central antery; PLS: periarterial lymphatic sheath; SC: splenic corpuscle; RP
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：2576427