【摘要】： 第一部分Hfq參與鼠疫菌致病的分子調控機制研究 背景:鼠疫是一種自然疫源性疾病,其病原體是鼠疫耶爾森菌(以下簡稱鼠疫菌)。鼠疫是一種人獸共患病,在自然界中主要以蚤類為傳播媒介寄居在特定的宿主(嚙齒動物)內,引起鼠疫的周期性爆發(fā),通過偶然與患畜接觸或被帶菌跳蚤叮咬進入人體,由皮下途徑感染,隨后進入血液循環(huán)系統,在淋巴結部位引發(fā)腺鼠疫,如果未加控制,最后將發(fā)展成為致命的肺鼠疫和敗血癥鼠疫。在這個過程中,有多種機制幫助鼠疫菌完成蚤體內生存、形成菌栓、在宿主體內黏附、侵襲、抗吞噬以及宿主細胞毒性等功能。鼠疫菌傳播過程和多宿主生活周期,決定了鼠疫菌必須存在多種適應宿主機制最終才能得以生存,并能在宿主間傳播以至最終致病。細菌中除了蛋白類的調控因子之外,還存在著一些發(fā)揮調控作用的非編碼RNA(non-coding RNA),即調控sRNA(regulatory small RNA)。這些調節(jié)sRNA,它們在轉錄后通常并不翻譯為蛋白質,廣泛存在于各種生物體中,在多種細胞過程中發(fā)揮調控作用。sRNA在轉錄起始、延伸、終止、mRNA穩(wěn)定性以及mRNA翻譯等環(huán)節(jié)上對靶基因進行調控,在染色體轉錄與失活、基因表達與關閉、細胞周期乃至個體發(fā)育等過程中均具有重要的作用,很可能對生物體的復雜性也起決定作用。其調節(jié)作用機制主要是利用序列互補或形成特定的“莖環(huán)結構”(stem-loop)。在細菌中,sRNA和蛋白類調控因子緊密協同,通過調節(jié)細胞生理過程來適應外界環(huán)境的變化。蛋白協同因子在sRNA和其靶mRNA配對結合的過程中具有重要作用。細菌sRNA與靶RNA的配對大都需要RNA伴侶分子Hfq蛋白的參與。Hfq是一種RNA結合蛋白,被認為是細菌基因轉錄后的關鍵調控因子。Hfq是高度保守的耐熱蛋白,在體內通常形成環(huán)狀六聚體,與真核生物RNA剪接中的Sm和Sm樣蛋白同源。目前Hfq參與相關sRNA調控功能的研究已有很多,但Hfq在病原細菌中的作用及其相關機制仍不清楚。結合其他病原菌Hfq研究現狀和鼠疫菌自身特點,我們推測:鼠疫菌Hfq蛋白可能通過sRNA發(fā)揮調節(jié)功能,影響到鼠疫菌毒力基因的表達調節(jié),最終影響到鼠疫菌的致病過程。然而,尚未見到關于鼠疫菌Hfq蛋白與鼠疫菌致病相關的任何報道。本課題旨在探討鼠疫菌Hfq蛋白與鼠疫菌抗吞噬和致病的關系,并探討其可能的分子調控機制。 方法:采用基于λ-Red重組系統的基因突變技術,以Km~R(卡那抗性盒)替代鼠疫菌hfq基因,構建鼠疫菌?hfq缺失突變株( hfq::Km~R),并同時構建其互補株(201Δhfq::Km~R/pACYC-hfq)。目前認為巨噬細胞內生存和繁殖是鼠疫菌感染機體早期的關鍵環(huán)節(jié)。而巨噬細胞涉及多個環(huán)境脅迫因素,如引發(fā)細菌熱休克反應、過氧化物、高滲、抗菌肽和營養(yǎng)缺乏等。根據上述鼠疫菌可能面臨的脅迫環(huán)境,我們確定了表型研究的主要內容。利用體外生長和存活實驗,比較上述對數中期的兩株菌對短期刺激(如熱、氧化脅迫)和長期刺激(如高鹽、抗菌肽和營養(yǎng)缺乏)的敏感性。Hfq蛋白很可能與鼠疫菌抗吞噬和細胞內存活能力密切相關,因此,我們設計細胞感染實驗來驗證這一想法。鼠疫菌感染鼠巨噬細胞系J774A.1后,觀察鼠疫菌野生株和?hfq突變株侵染能力和引起巨噬細胞毒性的病理學變化,比較其吞噬率和不同時間存活率的差異。為研究Hfq在鼠疫菌毒力及致病性過程中的作用,我們比較野生株和突變株的毒力變化,鼠疫菌野生株和?hfq突變株以不同途徑(靜脈或皮下)感染BalB/c小鼠,最終計算半數致死劑量(LD50);鼠疫菌野生株和突變株等量混合后,大劑量靜脈感染小鼠,分析動物體內臟器的細菌分布情況,并計算競爭指數(competitive index, CI)。通過體外芯片轉錄譜進行Hfq蛋白的轉錄后調控分析,體外培養(yǎng)鼠疫菌野生株和Δhfq突變株,分別提取總RNA,經過雙色熒光(Cy3-或Cy5)標記后,與鼠疫菌全基因組ORF芯片進行雜交(芯片轉錄譜分析),比較野生株和突變株各個對應基因轉錄水平的變化,在全基因組范圍內鑒定轉錄上調和下調的基因(轉錄后水平)。最后匯總上述所有數據,探討Hfq參與鼠疫菌致病的分子機制。 結果:成功的構建了鼠疫菌hfq突變株及其互補株。缺失hfq基因的鼠疫菌除生長速度減慢外,對熱、氧化劑、抗菌肽和營養(yǎng)缺乏的敏感性增加。缺失hfq基因后,鼠疫菌細胞相關細菌(cell-associated bacteria)沒有明顯改變,而吞噬率(phagocytosis percent)和早期存活率(survival percent)下降。缺失hfq基因的鼠疫菌毒力明顯下降,同時突變株在小鼠臟器內的分布數量明顯下降,證明Hfq蛋白控制著鼠疫菌毒力和體內生存力。缺失hfq基因引起了鼠疫菌243個共超過13類的基因轉錄水平變化。這些基因的功能涉及到小分子的降解,大分子的合成調控及降解、調控子、細胞被膜、致病性相關、轉運/結合蛋白、能量代謝、質粒源的蛋白等。其中56個基因(約23%)的基因可能參與鼠疫菌毒力或環(huán)境適應反應。 結論:Hfq在鼠疫菌對抗熱、氧化壓力、營養(yǎng)缺乏以及抗菌肽的過程中有重要作用,但是在鼠疫菌對高鹽(高滲)的耐受中則不是必須的。提示Hfq可能參與鼠疫菌抵抗多種體外脅迫條件(熱、氧化應激、抗菌肽、營養(yǎng)缺乏等),這些體外條件與巨噬細胞內微環(huán)境吻合。因此,Hfq在鼠疫菌侵染巨噬細胞過程中可能起到重要作用。我們的細胞感染實驗結果也證實:Hfq蛋白可能與鼠疫菌抗吞噬和細胞內存活能力密切相關, Hfq可能通過調控下游基因的表達,調節(jié)鼠疫菌抗吞噬和胞內存活特性。同時Hfq對于鼠疫菌致病性至關重要,對鼠疫菌的毒力以及在小鼠體內生長和繁殖過程是必不可少的。?hfq突變株與野生株相比共有243個基因發(fā)生轉錄水平的變化,其中有23%的基因可能與鼠疫菌應激或毒力相關。這表明Hfq可能參與鼠疫菌多種生理及致病相關過程。匯總上述所有數據并總結現有研究結果的基礎上,我們提出了Hfq參與鼠疫菌致病可能的分子機制,即Hfq通過與sRNA相互作用,調節(jié)應激蛋白和毒力因子的表達,參與鼠疫菌的體外應激、抗吞噬和致病過程。 第二部分KatA和KatY在鼠疫菌抗氧化過程中的作用及其調控研究 背景:鼠疫菌是鼠疫的病原菌,在其感染機體早期是一種兼性胞內致病菌。鼠疫菌在蚤體內和哺乳動物體內傳播,通過帶菌跳蚤的叮咬,或是與染菌動物等接觸進入人體。當鼠疫菌進入宿主后,首先被局部淋巴組織中的吞噬細胞(包括多形核白細胞PMNs和巨噬細胞)吞噬。單核細胞中的鼠疫菌被殺死,而被巨噬細胞吞噬的鼠疫菌則在巨噬細胞中可以存活和繁殖。吞噬細胞產生的過氧化氫是在鼠疫釋放至細胞外之前主要的脅迫因素。所以,鼠疫菌可能具有嚴格的適應抵御氧化壓力的機制以應對過氧化氫介導的殺菌作用。鼠疫菌具有較高的氧化抗性,但其抗氧化機制目前還不清楚。KatY在鼠疫菌中作為一種溫度依賴性抗原被發(fā)現。假結核耶爾森菌中也有KatY在低鈣響應中表達,但是小腸結腸炎耶爾森菌中則沒有發(fā)現KatY的存在。根據基因組注釋信息,鼠疫菌的katA基因和katY基因都編碼過氧化氫酶/過氧化物酶。從芯片轉錄譜分析的結果看,上述兩個基因的轉錄均受到體外低濃度H2O2的誘導,katA和katY基因轉錄水平增加的倍數分別是2.5倍和3.2倍。結合OxyR的調控元分析,我們認為上述兩個基因很可能是OxyR的靶標基因。與此同時,芯片雜交的結果還顯示,基因katA和katY均受溫度調控,但二者調節(jié)方向卻是相反的。鼠疫菌培養(yǎng)溫度由26°C上升到37°C時,基因katY轉錄水平上調,而katA基因轉錄水平發(fā)生下調。據此我們推測在不同培養(yǎng)溫度下的鼠疫菌對H2O2的敏感性可能不同。經過序列比對,確定KatY是一個過氧化氫-過氧化物酶。katY基因與鼠疫菌編碼呼吸細胞色素的基因cybB及cybC相連,且其啟動子共用一個pCD1編碼溫度感應轉錄激活子LcrF的一致識別序列。缺失pCD1質粒的突變株中KatY的活性依然具有溫度依賴性,所以顯然KatY不僅受LcrF的調控。由于KatY具有分解巨噬細胞產生的過氧化氫的能力而且具有溫度依賴性,推測它是一個重要的毒力因子。但是仍然不清楚的是過氧化氫酶是如何參與鼠疫菌生理和致病過程的。本課題在研究KatA及KatY在鼠疫菌抗氧化機制中作用的同時進行其調控因素的研究。研究鼠疫菌表達過氧化物酶/過氧化氫酶在鼠疫菌抗氧化過程的作用,及其調控因素,對于研究鼠疫菌抗氧化機制具有重要意義,為研究鼠疫菌胞內存活機制提供依據。 方法:采用基于λ-Red重組系統的基因突變技術,以抗性盒替代鼠疫菌katA、katY基因,構建鼠疫菌ΔkatA、ΔkatY、ΔoxyR缺失突變株以及ΔoxyR-ΔkatA、ΔoxyR-ΔkatY雙突變株,并同時構建其互補株。此外,構建在無觸酶活性的大腸桿菌UM255株中的KatA和KatY蛋白表達菌株。通過凝膠染色實驗以及過氧化氫酶/過氧化物酶活性直接測定來確定KatA和KatY的酶活性。隨后,利用H2O2抗性紙片實驗研究KatA及KatY在鼠疫菌體外抗氧化過程中的作用。最后通過一系列不同條件下的lacZ報告基因融合實驗研究katA和katY的轉錄調控方式,以及分子生化實驗驗證OxyR對katA和katY的調控。 結果:成功的構建了ΔkatA、ΔkatY、ΔoxyR缺失突變株以及ΔkatA-ΔkatY、ΔoxyR-ΔkatA、ΔoxyR-ΔkatY雙突變株,及其互補株。成功表達并純化了KatA和KatY蛋白。凝膠染色實驗以及過氧化氫酶/過氧化物酶活性直接測定顯示,KatA是一個單功能的過氧化氫酶,而KatY是過氧化氫酶/過氧化物酶。鼠疫菌的野生株在對數中期對H2O2具有高度抗性,與野生株相比在對數早期katY突變株對H2O2更加敏感。在對數中期, katY突變株與野生株對H2O2的抗性基本相同。鼠疫菌201野生株中β-半乳糖苷酶活性與?oxyR突變株相比,超過3倍,表明鼠疫菌OxyR可能由生長過程中產生的外源過氧化氫刺激而激活。證明katA和katY均受OxyR的調控。與26°C相比,37°C時鼠疫菌katY基因轉錄水平增加,而katA轉錄水平無顯著變化,提示katY基因的轉錄受到溫度的調節(jié)。鼠疫菌oxyR突變株在26℃生長時katA啟動子活性在不同時期顯示出明顯的變化。在靜止期katA啟動子活性最高。然而katY啟動子活性在同樣的條件下并沒有發(fā)生明顯的改變。被巨噬細胞吞噬后,與0時間點相比katY啟動子的活性在5小時時增加約69倍,在2小時時增加約6倍。而katA啟動子的表達則沒有這樣的變化。EMSA實驗結果顯示OxyR與katA及katY基因啟動子區(qū)均發(fā)生結合。DNase I足跡實驗結果顯示OxyR與katY轉錄起始位點上游68-110bp以及katA轉錄起始位點上游151-186bp處結合。 結論:我們的實驗證實了鼠疫菌KatA和KatY的催化性質與典型的過氧化氫酶相似。KatA是鼠疫菌在多種生長時期表達的主要過氧化氫酶。結果說明,KatA在鼠疫菌對抗過氧化氫刺激過程中具有主要的作用,與其他致病菌中對抗氧化殺傷的單功能過氧化氫酶相同。但是鼠疫菌KatY是一個雙功能過氧化氫酶,可能不再發(fā)揮傳統的生理作用。鼠疫菌KatA(HPII)和KatY(HPI)受過氧化反應調控子OxyR的調控,而大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)中HPII則不受OxyR的調控。這說明OxyR的功能即使在相似的腸道菌屬種也是不同的。但是OxyR在katA及katY中的DNA識別位點與大腸桿菌OxyR的DNA識別位點相似,說明在不同的菌中OxyR的調控機制是相似的。?oxyR突變株katY基因轉錄顯示出溫度依賴性表達,而KatA受到生長時期調控。KatA和KatY的調控應進一步研究。Garcia提出,LcrF不是KatY溫度調控的唯一調控子。已知的RNA溫度調控子位于特定的熱休克或是毒力基因5’-非翻譯區(qū),通過與核糖體結合位點的溫度依賴性堿基配對結合來調控翻譯。katY的5’-非翻譯區(qū)的二級結構經預測顯示出具有ROSE樣RNA溫度計(RNA thermometer)相關性質�？赡艿腞NA溫度計是否對調控KatY翻譯應進一步研究。鼠疫菌在宿主巨噬細胞內可以存活并增殖。鼠疫菌與宿主巨噬細胞件的相互作用可能是其致病性的關鍵。KatY受到溫度及過氧化氫的調控,這是吞噬溶酶體內微環(huán)境的兩個主要部分。細菌在胞內生長時KatY的水平升高,這說明鼠疫菌KatY可能在感染過程中巨噬細胞內的存活及生長中具有重要作用。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R516.8;R378

【參考文獻】

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1 巨立中,成軍,鐘彥偉;啟動子DNA結合蛋白研究策略[J];世界華人消化雜志;2004年01期

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本文編號：2574035