【摘要】：目的：動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis, EAE)小鼠視網(wǎng)膜多巴胺能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(dopaminergic amacrine cell,DAC)、眼特化區(qū)域分離(eye-specific segregation)和離視網(wǎng)膜投射的變化結(jié)合病理學(xué)、分子生物學(xué)等方法，研究EAE小鼠發(fā)病期視覺(jué)功能障礙的可能機(jī)制。 方法： C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（20只）和EAE組(50只)。首先參照Mendel I造模方法并加以改進(jìn)，采用短肽鏈的髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55（MOG35-55）作為抗原誘導(dǎo)C57BL/6小鼠EAE模型。自免疫當(dāng)天開(kāi)始觀察記錄小鼠基本情況，根據(jù)Webster等[15]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。其次EAE組再隨機(jī)分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只，各個(gè)亞組小鼠在抗原免疫后13d、18d、23d、28d、38d進(jìn)行雙眼玻璃體內(nèi)熒光染料注射，左眼注射Alexa-488（綠），右眼注射Alexa-555（紅），注射量均為1.5ul。各組小鼠染料注射完成48h后，即抗原免疫后l5d、20d、25d、30d、40d處死，取小鼠視神經(jīng)切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色和Luxol FastBule髓鞘染色后光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，統(tǒng)計(jì)視神經(jīng)炎發(fā)病率；取腦組織固定后置于熒光顯微鏡下觀察球后視通路、LGN和SC的變化情況；觀察并記錄整體觀情況后，瓊脂包埋腦組織振動(dòng)切片機(jī)切片，收集LGN部分異側(cè)投射面積最大的3片和SC部分最靠近中線的4片，在熒光顯微鏡下觀察眼特化區(qū)域分離情況并攝片，利用Matlab圖象分析軟件進(jìn)行圖像處理并計(jì)算切片的同側(cè)(ipsilateral)眼睛軸突投射面積、同側(cè)(ipsilateral)和異側(cè)(contralateral)投射區(qū)域重疊的面積。用免疫熒光染色檢測(cè)視網(wǎng)膜各時(shí)間點(diǎn)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)表達(dá)，計(jì)數(shù)多巴胺能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(dopaminergic amacrine cell, DAC)數(shù)目。 結(jié)果： 1、EAE組小鼠臨床發(fā)病率96%，高峰癥狀評(píng)分（3.53±0.75）分，視神經(jīng)炎發(fā)病率77.1%（病理診斷）。 2、 EAE小鼠雙眼特化區(qū)域分離障礙。LGN雙眼特化區(qū)域分離結(jié)果：免疫后15d，EAE組雙側(cè)投射重疊面積與Saline組均無(wú)明顯差異；免疫后20、25、30d EAE組雙側(cè)投射重疊面積與Saline相比均顯著增加；SC雙眼特化區(qū)域分離結(jié)果：免疫后20d開(kāi)始EAE組雙側(cè)投射重疊面積較Saline組顯著增加，25d達(dá)最高值（P=0.0012）。 3、EAE小鼠視網(wǎng)膜DACs減少：同Saline組相比，免疫后20d, EAE小鼠DACs數(shù)目開(kāi)始減少；25d時(shí)與Saline組有顯著性差異。 4、EAE小鼠球后視通路損傷：EAE組免疫后15、20、25、30d，腦組織整體觀視通路顯示正常，SC、LGN均清楚可見(jiàn)。免疫后40d，SC可見(jiàn)，4只小鼠LGN僅殘留部分可見(jiàn)，1只LGN完全缺失，1只顯示正常。發(fā)生ON的EAE小鼠中，免疫40d時(shí)，第一視通路損傷發(fā)生率83.33%。 結(jié)論： 1、MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6小鼠EAE模型，發(fā)病率高，重復(fù)性好，視神經(jīng)病理?yè)p傷明顯，是研究ON和MS的理想模型。 2、EAE小鼠視覺(jué)功能損傷主要由兩方面所致： ①發(fā)病早期視覺(jué)信息處理障礙；②中后期視覺(jué)信號(hào)傳遞受阻。 3、EAE小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)多巴胺能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞減少進(jìn)而導(dǎo)致各類細(xì)胞耦合發(fā)生異常，，可能是視覺(jué)信息處理障礙的原因之一。 4、EAE小鼠球后通路以第一視通路破壞為主，由近中樞端向視網(wǎng)膜側(cè)發(fā)展，導(dǎo)致視覺(jué)信號(hào)傳遞受阻，同時(shí)為神經(jīng)再生研究提供了理論依據(jù)和證據(jù)支持。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R-332;R744.51

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本文編號(hào)：2571993