發(fā)布時間：2020-01-22 07:44

【摘要】：目的:在E.coli BL21中表達pET-30a/nspA、pET-30a/ltB及pET-30a/ltB-nspA重組蛋白,純化復(fù)性后,分析其抗原性及免疫原性。通過鼻飼免疫BALB/c小鼠,檢測其所誘發(fā)的體液免疫(尤其是粘膜免疫應(yīng)答)和細胞免疫應(yīng)答水平,為研制新型、高效的淋球菌蛋白疫苗提供實驗依據(jù)。 方法: 1.轉(zhuǎn)化pET-30a/nspA、pET-30a/ltB、pET-30a/ltB-nspA原核重組質(zhì)粒,行PCR及雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。 2.重組體的表達、純化及鑒定。誘導(dǎo)重組體pET-30a/nspA、pET-30a/ltB及pET-30a/ltB-nspA在E.coli BL21中表達重組蛋白,優(yōu)化IPTG濃度和表達時間;Ni+-NTA親和層析柱純化重組蛋白;采用SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定表達產(chǎn)物。 3.重組蛋白的免疫活性測定。純化的重組蛋白透析復(fù)性,BCA法測定蛋白濃度,以LTB-NspA,NspA重組蛋白鼻飼免疫4w齡BALB/c小鼠,同時設(shè)置重組蛋白LTB及蛋白溶解液(Solution Buffer)對照組,首次免疫的當天,及其后免疫的第2w、第4w和末次免疫的2w后行小鼠尾靜脈采血,分離血清及PBS灌洗小鼠生殖道,收集生殖道灌洗液,間接ELISA法檢測血清中NspA的特異性IgG水平及生殖道灌洗液中NspA的特異性SIgA水平。末次免疫后2w取小鼠脾細胞于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后,MTT法檢測脾淋巴細胞的增殖,分別用ELISA法檢測脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中的INF-γ和IL-4水平。 結(jié)果: 1.將pET30a/nspA、pET30a/ltB、pET30a/ltB-nspA原核表達載體轉(zhuǎn)入E.coli BL21,IPTG誘導(dǎo)后均獲得了重組融合蛋白表達,Western-blot分析表達的蛋白均有較強的抗原性,能與抗NspA的特異性抗體結(jié)合,其效價達到1:6400以上。 2.重組蛋白免疫后,實驗組NspA、LTB-NspA小鼠生殖道粘膜SIgA水平均明顯高于對照組LTB、蛋白溶解液組(Solution Buffer)(P0.01);脾淋巴細胞增殖反應(yīng)測定,蛋白疫苗LTB-NspA組和NspA組小鼠脾淋巴細胞經(jīng)特異性抗原NspA刺激后,刺激指數(shù)分別為(1.63±0.265)和(1.59±0.254),明顯高于LTB組(1.11±0.183)、蛋白溶解液組(Solution Buffer) (1.08±0.162)(P0.01),實驗組NspA與LTB-NspA間無明顯差異(P0.05)。 3.蛋白疫苗免疫組小鼠脾淋巴細胞經(jīng)特異性抗原NspA刺激后,培養(yǎng)上清中IFN-γ含量明顯升高, NspA組達(134.58±14.17 pg/mL),LTB-NspA組達(142.23±21.25 pg/mL),與LTB組(46.12±5.61 pg/mL)和蛋白溶解液組(6.13±1.06 pg/mL)之間有顯著性差異(P0.01),實驗組NspA與LTB-NspA間無明顯差異(P0.05);兩實驗組小鼠脾淋巴細胞經(jīng)特異性抗原NspA刺激后,培養(yǎng)上清中IL-4含量明顯升高,實驗組的NspA(82.26±7.42 pg/mL)和LTB-NspA(86.14±8.24 pg/mL)明顯高于LTB組(36.52±2.34 pg/mL)和蛋白溶解液(Solution Buffer)(31.15±1.32 pg/mL)對照組,差異具有顯著性(P0.05); NspA和LTB-NspA兩組間IL-4的水平無顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論: 1.原核表達重組體pET-30a/nspA、pET-30a/ltB及pET-30a/ ltB-nspA,在E.coli BL21中成功獲得了表達; 2.重組蛋白經(jīng)鼻飼免疫小鼠后,誘發(fā)了一定水平的特異性體液免疫和細胞免疫,實驗組LTB-NspA和NspA誘導(dǎo)的IgG、IL-4、IFN-γ水平以及脾淋巴細胞增殖刺激指數(shù),均明顯高于對照組; 3.含粘膜佐劑的LTB-NspA所誘發(fā)的粘膜特異性SIgA水平明顯高于不含粘膜佐劑的NspA;但二者誘導(dǎo)的IgG、IL-4、IFN-γ水平以及脾淋巴細胞增殖刺激指數(shù)差異無顯著性。
【圖文】：

載體經(jīng) PCR 和 BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定圖譜(1%瓊ose gel electrophoresis profile of PCR product and digestant vectors Marker(DL15000);roduct of the plasmid pET-30a/ltB-nspA digested by BamHⅠ roduct of the plasmid pET-30a/nspA digested by BamHⅠ anroduct of the plasmid pET-30a/ltB digested by BamHⅠ androduct of the wild plasmid pET-30a digested by BamHⅠ andCR product of LTB-NspA from the plasmid pET-30a/ltB-nspCR product of NspA from the plasmid pET-30a/nspA;CR product of LTB from the plasmid pET-30a/ltB;p DNA Ladder.

重組體在 E.coli BL21 中的表達組表達菌增菌培養(yǎng)，加入 1.0 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達 1h、2h菌，SDS-PAGE 顯示：重組表達菌泳道均比對照菌泳道多(約 26kD)和 LTB-NspA(約 39kD)，，見圖 2；LTB(約 14.4kD 4h 表達趨于飽和。加入濃度梯度的 IPTG(0.5mmol/L，，2.0mmol/L) 在不同的溫度下誘導(dǎo)表達， SDS-PAGE 發(fā)現(xiàn)乎無影響(圖略)。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2571899