【摘要】： 本研究旨在構(gòu)建proEMAPⅡ/p43缺失突變體,探尋p43蛋白行使抗新生血管功能的結(jié)構(gòu)域,篩選分子量小、活性高的腫瘤治療候選藥物;建立體外檢測(cè)p43抗血管生成活性的方法;利用基因芯片高通量篩選p43作用于人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1后差異表達(dá)的基因,初步研究p43蛋白的作用機(jī)制。 本文利用內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移、管腔形成和雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)等體外檢測(cè)血管生成的模型研究p43蛋白抑制血管生成的活性。結(jié)果表明,p43體外能明顯抑制HMEC-1細(xì)胞遷移和管腔形成,但對(duì)HMEC-1細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期沒(méi)有顯著的量效關(guān)系。最終選用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和管腔形成實(shí)驗(yàn)作為p43蛋白主要活性檢測(cè)方法。同時(shí)制備了p43的多克隆抗體和單克隆抗體,為研究p43的生物學(xué)功能和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 通過(guò)對(duì)p43進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),構(gòu)建了10個(gè)缺失突變體。在大腸桿菌內(nèi)表達(dá),得到可溶性的缺失體蛋白,利用金屬鰲合層析和離子交換層析分離純化,得到純度達(dá)90%以上的目的蛋白。對(duì)純化后的缺失體蛋白進(jìn)行HMEC-1細(xì)胞遷移和管腔形成實(shí)驗(yàn),體外測(cè)定其抗血管生成活性,成功地篩選出3種活性高于全長(zhǎng)p43的缺失體蛋白。N端17-312位和80-312位氨基酸序列缺失突變體活性提高了3倍;C端1-264位氨基酸序列缺失體活性提高了2倍。結(jié)果表明,p43的1-79位和265-312位氨基酸片段不是p43蛋白發(fā)揮抗血管生成活性所必需的結(jié)構(gòu)域。 利用基因芯片篩選出p43作用于HMEC-1后差異表達(dá)的基因132個(gè),從中選出與血管生成相關(guān)的31個(gè)基因,用Real-time PCR法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,研究p43蛋白對(duì)其表達(dá)的調(diào)控,進(jìn)而從分子水平上揭示p43的作用機(jī)制。
【圖文】：

并受多種血管生成因子的調(diào)控，持續(xù)異常的血管生成會(huì)導(dǎo)致一系列的疾病，如糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化和惡性腫瘤。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成有著密切的關(guān)系。1971 年 Folkman[1]首先提出用抑制血管生成的方法治療腫瘤，現(xiàn)已有多種新生血管抑制劑類抗腫瘤藥物上市或進(jìn)入臨床新生血管抑制劑已經(jīng)成為腫瘤治療研究的前沿和熱點(diǎn)。一、 血管生成與腫瘤1 血管生成的過(guò)程血管生成是一個(gè)復(fù)雜的連續(xù)的過(guò)程，人為地可分為 6 個(gè)相對(duì)獨(dú)立的步驟：(1釋放多種血管生成因子；(2)在血管生成因子的作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變；(3) 釋放多種蛋白溶酶降解細(xì)胞外基質(zhì)和毛細(xì)血管基底膜，繼而引起細(xì)胞外基質(zhì)重塑；(4)內(nèi)皮細(xì)胞遷移到刺激部位形成血管新芽；(5)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖；(6)新生內(nèi)皮細(xì)胞索形成管腔，血管結(jié)構(gòu)重建[2,3]（圖 1）。

/p43 的研究背景43 的簡(jiǎn)介內(nèi)皮單核細(xì)胞活化多肽（EMAPⅡ）的前體Q 等人發(fā)現(xiàn)。人的 p43 基因位于 4 號(hào)染色體外顯子，，ATG 位于第 2 個(gè)外顯子上。其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)產(chǎn)物即 p43 蛋白由 312 個(gè)氨基酸殘基組成，空間結(jié)構(gòu)未知，但 COOH 端結(jié)構(gòu)已知，主要OB-fold）和一個(gè)β-barrel 結(jié)構(gòu)[32]（見(jiàn)圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2570949