【摘要】： 目的:①.通過聯(lián)合應用馬血清(Equine Serum,ES)和低劑量甲基強的松龍(methylprednisolone,MPS)的方法,探討建立激素性兔股骨頭缺血性壞死動物模型的可行性;②.體外分離、接種、培養(yǎng)、擴增兔ASCs并鑒定,觀察其生物學特性并探討其體外培養(yǎng)適宜條件;③.觀察長期傳代對ASCs誘導成骨分化的影響,以探討ASCs在組織工程和再生醫(yī)學上的應用前景。 方法:①.20只健康日本大耳白兔隨機分成實驗組和對照組(A組和B組),A組14只動物第1次通過兔耳緣靜脈按10ml/Kg量注入馬血清,間隔2周后,連續(xù)2天按5ml/Kg再次注入馬血清,第1次注射馬血清24小時后即于臀肌注射4mg/KgMPS,以后每隔1周注射1次,共8周。B組6只動物單純注射同等量的生理鹽水,所有的動物飼養(yǎng)在動物籠中并給予標準的食物和水喂養(yǎng)。于第1次注射馬血清前、注射MPS后2周、4周、8周行血液學檢查。并分別于注射MPS后4周和8周行X線影像學、MRI檢查、HE染色和電鏡觀察股骨頭缺血壞死情況。 ②.用Ⅰ膠原酶消化取自兔頸后部的皮下脂肪組織,采用含胎牛血清的DMEM進行體外培養(yǎng)。比較不同膠原酶濃度、膠原酶消化時間對兔ASCs體外培養(yǎng)生長特性及增殖能力的影響。免疫熒光檢測ASCs表面標記物的表達,通過成骨和成脂誘導劑誘導其向脂肪細胞與成骨細胞分化,Von Kossa染色和堿性磷酸酶染色鑒定成骨分化,Oil Red O染色鑒定成脂分化情況。 ③.將傳至3、6、9、12、15代的ASCs通過rhBMP-2向成骨誘導,誘導培養(yǎng)1周、2周后,行Von Kossa鈣結節(jié)染色及CAKP染色鑒定細胞成骨分化,并檢測成骨標志產物AKP的活性和Ca+離子的濃度,檢測ASCs長期傳代對其成骨能力的影響。 結果:①.實驗組因急性全身免疫反應死亡2只動物,余動物均存活并順利通過實驗。甘油三酯、膽固醇在2周、4周、8周時均明顯上升,與對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05);激活部分凝血活酶時間(Actived partial thromboplastin time,APTT)則明顯下降,與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05)。造模2周時X線表現(xiàn)與對照組比較無明顯改變,4周時干骺端可見低密度影,似見囊變區(qū),8周時關節(jié)間隙模糊不清,骨質結構不清; MRI檢查4周部分動物可見局部信號改變,8周時可見皮質下出血;HE染色顯示骨髓周圍有壞死的骨髓細胞碎片存在,空骨陷窩率4周及8周逐漸增加,與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01);電鏡觀察,4周時個別骨細胞結構模糊不清,或有大空泡;8周時部分骨細胞核破裂、核溶解,凋亡細胞大量出現(xiàn),骨膠原結構排列紊亂;②.從兔頸后脂肪組織中培養(yǎng)出ASCs細胞,其體外增殖迅速,倍增穩(wěn)定,體外傳18代增殖能力無明顯降低(P0.05),免疫熒光檢測ASCs的表面抗原CD44陽性,且細胞保持未分化狀態(tài),經成骨誘導培養(yǎng)后出現(xiàn)鈣沉積;經成脂肪誘導后形成脂肪滴;采用1.0、1.5、2.0 mg/ml三種不同膠原酶濃度進行消化,發(fā)現(xiàn)在消化時間為0.5h和1h時,2.0 mg/ml組消化細胞總數(shù)最多,細胞總數(shù)與其他組比較,差異有顯著意義。在消化時間為1.5h時,消化細胞總數(shù)較0.5h和1h均有增加,同時,1.0、1.5和2.0 mg/ml組消化細胞總數(shù)無統(tǒng)計學差異,活細胞比值1.0mg/ml組最高,但與其他組無統(tǒng)計學差異,觀察第3代細胞生長特性,1.0mg/ml消化1.5h組別具有更好的增殖活性;③.經rhBMP-2成骨誘導1周、2周后,成骨標記物AKP、Ca+濃度與對照組比較差異有顯著性(P0.O1),AKP濃度在P12代之前無統(tǒng)計學差異(P0.05),P15代與P9代之前均有統(tǒng)計學差異,Ca+濃度P12代之前無統(tǒng)計學差異(P0.05);P15代與P12代之前均有統(tǒng)計學差異(P0.05),Von Kossa染色出現(xiàn)鈣結節(jié),堿性磷酸酶染色顯示胞漿出現(xiàn)紅棕色顆粒存在。 結論: ①.聯(lián)合運用激素和馬血清明顯提高ANFH的發(fā)生率,能夠較好地建立激素性兔ANFH動物模型; ②.從兔脂肪組織中可獲得ASCs細胞,具有多向分化能力,具有較強的自我增殖能力,有可能成為骨組織工程想的種子細胞之一; ③.膠原酶濃度1.0mg/ml、消化時間1.5h是較好的獲取ASCs細胞的方法; ④.ASCs在12代以前其成骨能力無明顯改變,有可能為骨組織工程提供大量的有活性的種子細胞。
【圖文】：

對照組 2周 4周 8周圖 1-1 兔血甘油三酯及膽固醇在 2 周、4 周、8 周時的變化表 1-1 各組 APTT 各時間點的結果( X +S)時間 Ａ組◇ Ｂ2 周 25.10±0.36 39.22±4 周 17.87±0.47☆ 39.16±8 周 17.10±0.51★ 38.68±與Ｂ組相比較，APTT 均有顯著性差異，P<0.05；☆與第 2 周比意義，P<0.05；★與 2、4 周比較差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。圖 1-圖 A 面完見，

圖ATR520，TE26短T1短T2，，正常股骨頭T1WI表現(xiàn)
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2565064