【摘要】： 禽流感病毒(AIV)屬正粘病毒科A型流感病毒,禽流感病毒尤其高致病性的H5N1型禽流感病毒已經(jīng)跨越種屬屏障直接引起人類感染并致感染者死亡。1997年首次發(fā)現(xiàn)H5N1流感病毒從禽感染到人并引起死亡,之后不斷有散發(fā)感染病例出現(xiàn)。特別是2003年底以來(lái),世界上已有15個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)告有高致病性H5N1型流感病毒感染人的病例,已有423人感染,其中258人死亡,死亡率高達(dá)61%。雖然主要集中在亞洲,但歐洲和非洲也有感染病例出現(xiàn),并且在上述國(guó)家和地區(qū)同時(shí)出現(xiàn)大規(guī)模家禽感染死亡,對(duì)人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展都造成了巨大影響,引起了各國(guó)的高度關(guān)注。 A型流感病毒顆粒表面存在兩種由糖蛋白組成的棘突,即血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA),依靠它們可以把A型流感病毒分成很多亞型。同時(shí),由于它們是流感病毒的主要表面抗原蛋白,可以刺激機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù),又由于它們的變異可致流感病毒發(fā)生抗原漂移和轉(zhuǎn)換,產(chǎn)生新的亞型和變異株,對(duì)這兩個(gè)蛋白,特別是血凝素(HA)抗原性的研究,不但可以揭示流感病毒的抗原變異規(guī)律也可為疫苗的研發(fā)提供理論指導(dǎo)。已有研究證明,H5亞型上至少5個(gè)中和抗原表位(A、B、C、D和E)均位于HA的重鏈區(qū)HA1,各表位之間存在著一定程度的氨基酸區(qū)域重疊,但其區(qū)域大小及精細(xì)結(jié)構(gòu)尚未確定。為進(jìn)一步探索H5N1禽流感病毒HA蛋白的抗原表位及其結(jié)構(gòu)功能,深入了解病毒的免疫保護(hù)抗原及病毒的致病機(jī)制,我們開(kāi)展了H5N1禽流感病毒HA蛋白的抗原表位及其結(jié)構(gòu)功能的研究。 本研究的思路是:利用我們自行從人感染標(biāo)本中分離的人源H5N1禽流感病毒株A/Beijing/01/03,制備多克隆血清抗體和多株特異性單克隆抗體,同時(shí)將該病毒的HA基因片段進(jìn)行分段表達(dá),利用多克隆和單克隆抗體分析各肽段的免疫反應(yīng)性來(lái)鑒定及定位HA上的相關(guān)抗原表位,分析抗原表位的功能,確定單抗識(shí)別的氨基酸序列及表位構(gòu)象。通過(guò)用單抗對(duì)流感病毒HA的抗原表位進(jìn)行精細(xì)分析,為研發(fā)新型重組疫苗和多表位疫苗提供理論指導(dǎo)。此外,為了探索H5N1病毒跨越種屬屏障直接從禽類感染人類的分子基礎(chǔ),我們又進(jìn)行了10株人及野鳥(niǎo)H5N1分離株在人靶細(xì)胞上復(fù)制能力及拮抗人細(xì)胞因子等的差異研究。 首先,我們根據(jù)人H5N1病毒A/Beijing/01/03株的HA1基因編碼區(qū)984bp的序列,利用生物分析軟件Oligo6.0設(shè)計(jì)了17條引物(共16對(duì)),采用常規(guī)PCR方法,利用這些引物分別擴(kuò)增出HA1的16個(gè)不同長(zhǎng)度的重疊肽的基因片段。利用限制性內(nèi)切酶雙酶切,將16條不同長(zhǎng)度的HA1基因片段克隆到pDisplay載體中,篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定,構(gòu)建了16個(gè)重組質(zhì)粒pDisplay-HA1-1~10及pDisplay-HA1-1’~6’。測(cè)定16個(gè)真核表達(dá)重組質(zhì)粒的濃度及純度,轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,各HA1蛋白重疊肽段均獲得成功表達(dá)。將表達(dá)各HA1重組肽段的細(xì)胞制備成各HA1肽段抗原片,建立起間接免疫熒光檢測(cè)方法,用于抗原表位分析。 其次,我們制備了抗H5N1(A/Beijing/01/03株)的單克隆抗體和多克隆抗體并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究。用甲醛滅活的病毒雞胚尿囊免疫動(dòng)物三次后,對(duì)小鼠血清檢測(cè)出現(xiàn)特異性抗體者,取脾進(jìn)行細(xì)胞融和實(shí)驗(yàn),有限稀釋克隆法篩選單克隆抗體細(xì)胞株,建立了12株穩(wěn)定分泌抗AIV抗體的雜交瘤細(xì)胞。對(duì)自行制備的12株單抗和車小燕研究員惠贈(zèng)的18株單抗的免疫學(xué)特性如抗體效價(jià)、血凝抑制活性、中和效價(jià)、單抗對(duì)HA蛋白特異性的識(shí)別等進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示,應(yīng)用間接免疫熒光方法測(cè)定全部30株雜交瘤腹水效價(jià)均在320-20480之間;發(fā)現(xiàn)13株McAb對(duì)病毒有較高的血凝抑制活性;用單抗對(duì)表達(dá)的HA1全長(zhǎng)肽段進(jìn)行識(shí)別檢測(cè),發(fā)現(xiàn)18株單抗對(duì)HA蛋白是特異性的;采用微量細(xì)胞培養(yǎng)中和試驗(yàn)測(cè)定了18株抗HA1單抗,6株具有中和抗體活性,中和效價(jià)在1㑳52~1㑳2032之間。同時(shí),用滅活病毒免疫小鼠,成功地制備出了高效價(jià)的鼠抗H5N1多克隆血清抗體。 第三,利用H5N1病毒特異性單抗及多克隆血清抗體采用間接免疫熒光法檢測(cè)表達(dá)的禽流感病毒HA蛋白重疊肽抗原,分析HA的抗原表位及優(yōu)勢(shì)抗原表位。將每株單抗分別與16個(gè)表達(dá)的HA1重疊肽段結(jié)合,確定單抗識(shí)別的肽段區(qū)域,并對(duì)單抗的識(shí)別表位特征進(jìn)行分析。同樣方法,利用制備的多抗與表達(dá)的HA1各重疊肽段進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)性分析,確定HA蛋白上的優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)域。初步分析確定3B5、3D1、3B2、M6、M3等18株單抗識(shí)別表位區(qū)域分別位于氨基酸殘基aa133-143,aa155-165,aa166-196,aa166-176,aa34-66及aa296-328之間,其中3B5、3D1、3B2、M6等單抗識(shí)別的表位為序列依賴型表位,M3和M7等具有中和活性的單抗所識(shí)別表位為構(gòu)象性中和表位。將18株單抗識(shí)別的抗原表位在HA分子一級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上進(jìn)行定位,確定了它們?cè)谌SHA中的位置。通過(guò)分析,初步確定HA1蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)為aa133-165 ,序列為IPKSSWSNHEASSGVSSACPYLGRPSFFRNVVW。這些結(jié)果為進(jìn)一步了解HA抗原表位相關(guān)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了重要數(shù)據(jù),對(duì)探索流感病毒抗原變異規(guī)律和新型疫苗的研發(fā)具有一定的理論意義。 第四,對(duì)A/Beijing/01/03等10株人及野鳥(niǎo)源H5N1病毒在人體靶細(xì)胞上復(fù)制能力差異的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。首先進(jìn)行了人及野鳥(niǎo)H5N1病毒分離株空斑滴度測(cè)定,又進(jìn)行了10株分離株在人A549細(xì)胞上復(fù)制能力以及對(duì)人IFN和TNF等細(xì)胞因子的敏感性檢測(cè),并對(duì)病毒基因組全序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,人H5N1病毒株跨越種屬屏障感染人可能與其在人體靶細(xì)胞的高效復(fù)制能力有著密切關(guān)系;初步確定NS1蛋白上三處氨基酸殘基的突變可能與病毒適應(yīng)人細(xì)胞復(fù)制有關(guān)。成功的構(gòu)建了人H5N1病毒(A/Vietnam/1194/2004)株NS1基因突變株,為H5N1病毒適應(yīng)并引起人類嚴(yán)重感染的分子生物學(xué)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。 通過(guò)上述研究,獲得以下結(jié)果:1、成功地構(gòu)建了一批表達(dá)HA不同長(zhǎng)度肽段的質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染LeLa細(xì)胞,獲得了真核細(xì)胞表達(dá),制備了一批抗H5N1病毒的單克隆抗體,并對(duì)單抗進(jìn)行了特性研究。這些肽段和單抗對(duì)研制甲型流感病毒特異診斷試劑具有重要的應(yīng)用價(jià)值;2、利用單抗和不同長(zhǎng)度的HA肽段對(duì)HA上抗原表位分析初步證明,HA1上存在著血凝型、非血凝型和中和型等多種抗原表位,血凝型抗原表位主要為序列依賴性表位;3、通過(guò)構(gòu)象分析證明,中和型表位主要為構(gòu)象表位;4、通過(guò)優(yōu)勢(shì)抗原表位分析,確定HA1蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)為aa133-165,序列為IPKSSWSNHEASSGVSSACPYLGRPSFFRNVVW。這些結(jié)果為進(jìn)一步了解HA抗原表位相關(guān)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究提供了重要數(shù)據(jù),對(duì)探索流感病毒抗原變異規(guī)律和新型疫苗的研發(fā)具有一定的理論意義。對(duì)A/Beijing/01/03等10株人及野鳥(niǎo)H5N1病毒在人體靶細(xì)胞上復(fù)制能力差異分子機(jī)制的初步分析發(fā)現(xiàn),人源H5N1病毒在人細(xì)胞上復(fù)制能力強(qiáng),可能是H5N1病毒感染人類的前提。NS1蛋白效應(yīng)區(qū)上3處氨基酸殘基突變可能與病毒適應(yīng)人體復(fù)制相關(guān),這對(duì)進(jìn)一步探索H5N1病毒的分子生物學(xué)致病機(jī)理提供了可參考的資料。
【圖文】：

1968 年毒株（H3N2）HA 分子的抗原表位結(jié)構(gòu)圖the solved structure of a 1968 strain of HA(H3 subtype，HA 由 329 氨基酸殘基組成的重鏈 HA1 和 175 個(gè)氨基酸構(gòu)成。在 HA 分子上通常確定有五個(gè)抗體結(jié)合表位：A（紅D（淺藍(lán)），E（深藍(lán)），均位于 HA1。蛋白上五個(gè)抗原表位區(qū)域（A-E）都已經(jīng)鑒定及序列測(cè)位。試驗(yàn)及分析表明，可能由于抗體選擇壓力，病毒其他區(qū)域快，特別是優(yōu)勢(shì)表位突變最快。Mu oz等通表位內(nèi)氨基酸位點(diǎn)突變率的統(tǒng)計(jì)觀察來(lái)確定相關(guān)的變率分別為 0.053 ， 0.14 ， 0.037 ， 0 ， 0.09 ，推斷/99 HA蛋白上為占優(yōu)勢(shì)的表位，E表位為次優(yōu)勢(shì)表位。抗原變異病原體的典型范例,似乎有逃避免疫應(yīng)答的年造成 50 萬(wàn)人死亡。抗病毒表面糖蛋白 HA 的抗體性，并且 HA 是流感疫苗的主要組分。但是 HA 的抗

17圖2 pDisplay載體結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The features and the multiple cloning site of pDisplay1.4 引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)人H5N1病毒株A/Beijing/01/03株的HA1基因編碼序列，真核表達(dá)載體pDisplay的基因圖譜和其多克隆酶切位點(diǎn)圖譜（圖2），利用生物分析軟件Oligo6.0確定上游和下游的酶切位點(diǎn)分別為SacⅡ和SalⅠ。設(shè)計(jì)17條引物（見(jiàn)表1，其中Primer 1和Primer 11為通用引物），擴(kuò)增16種HA1蛋白相互重疊的基因序列。擴(kuò)增引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，用無(wú)核酸酶水配制成濃度為20μM的儲(chǔ)存液，，-20℃保存?zhèn)溆谩?
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 喻正軍;金梅林;徐曉娟;張瑞華;陳煥春;;乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)H5亞型禽流感病毒血凝素抗體的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國(guó)免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第六次研討會(huì)論文集[C];2005年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前5條

1 王俊鳴;基因疫苗開(kāi)發(fā)是關(guān)鍵[N];科技日?qǐng)?bào);2004年

2 王琳;為什么人會(huì)患鳥(niǎo)類傳染�。縖N];人民政協(xié)報(bào);2004年

3 盧亦愚;臨床醫(yī)生須全面了解流感疫苗[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

4 鄭靈巧;禽流感對(duì)我們威脅有多大[N];健康報(bào);2003年

5 蔡fg東;禽流感病毒侵犯人類之謎[N];健康報(bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 夏玉坤;人源H5N1禽流感病毒株HA1蛋白抗原表位分析及在人靶細(xì)胞上復(fù)制能力差異的分子機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2009年

2 胡淳玲;麻疹病毒血凝素蛋白與受體的相互作用及麻疹病毒侵染機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2004年

3 張松林;偽狂犬病gE~-/gI~-基因缺失突變株及禽流感假病毒的構(gòu)建以及免疫效果的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

4 蒙學(xué)蓮;小反芻獸疫病毒血凝素蛋白及其受體的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前7條

1 顏淵清;蛋白結(jié)構(gòu)模擬預(yù)測(cè)H5型禽流感病毒保守中和表位及其抗病毒多肽的初步設(shè)計(jì)[D];廈門大學(xué);2007年

2 張鵬;麻疹病毒包膜糖蛋白與受體的相互作用及其相互作用功能位點(diǎn)研究[D];武漢大學(xué);2005年

3 周宇;H5N2亞型AIV HA基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及免疫試驗(yàn)[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

4 李賀;H7亞型禽流感基因工程亞單位疫苗的研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

5 江彥澤;可表達(dá)新型甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白輔助病毒依賴型腺病毒載體的構(gòu)建及初步鑒定[D];北京交通大學(xué);2012年

6 宋曉暉;H5N1亞型禽流感病毒HA1基因在大腸桿菌中的表達(dá)與純化[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

7 莫小見(jiàn);犬瘟熱病毒南京株（NJ-15）H基因的克隆、表達(dá)以及刺激犬B淋巴細(xì)胞分泌IgM的最佳CpG基序的體外篩選[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

本文編號(hào)：2564959