【摘要】： 禽流感病毒(AIV)屬正粘病毒科A型流感病毒,禽流感病毒尤其高致病性的H5N1型禽流感病毒已經(jīng)跨越種屬屏障直接引起人類感染并致感染者死亡。1997年首次發(fā)現(xiàn)H5N1流感病毒從禽感染到人并引起死亡,之后不斷有散發(fā)感染病例出現(xiàn)。特別是2003年底以來,世界上已有15個國家和地區(qū)報告有高致病性H5N1型流感病毒感染人的病例,已有423人感染,其中258人死亡,死亡率高達61%。雖然主要集中在亞洲,但歐洲和非洲也有感染病例出現(xiàn),并且在上述國家和地區(qū)同時出現(xiàn)大規(guī)模家禽感染死亡,對人類健康和經(jīng)濟發(fā)展都造成了巨大影響,引起了各國的高度關(guān)注。 A型流感病毒顆粒表面存在兩種由糖蛋白組成的棘突,即血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA),依靠它們可以把A型流感病毒分成很多亞型。同時,由于它們是流感病毒的主要表面抗原蛋白,可以刺激機體誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護,又由于它們的變異可致流感病毒發(fā)生抗原漂移和轉(zhuǎn)換,產(chǎn)生新的亞型和變異株,對這兩個蛋白,特別是血凝素(HA)抗原性的研究,不但可以揭示流感病毒的抗原變異規(guī)律也可為疫苗的研發(fā)提供理論指導(dǎo)。已有研究證明,H5亞型上至少5個中和抗原表位(A、B、C、D和E)均位于HA的重鏈區(qū)HA1,各表位之間存在著一定程度的氨基酸區(qū)域重疊,但其區(qū)域大小及精細結(jié)構(gòu)尚未確定。為進一步探索H5N1禽流感病毒HA蛋白的抗原表位及其結(jié)構(gòu)功能,深入了解病毒的免疫保護抗原及病毒的致病機制,我們開展了H5N1禽流感病毒HA蛋白的抗原表位及其結(jié)構(gòu)功能的研究。 本研究的思路是:利用我們自行從人感染標本中分離的人源H5N1禽流感病毒株A/Beijing/01/03,制備多克隆血清抗體和多株特異性單克隆抗體,同時將該病毒的HA基因片段進行分段表達,利用多克隆和單克隆抗體分析各肽段的免疫反應(yīng)性來鑒定及定位HA上的相關(guān)抗原表位,分析抗原表位的功能,確定單抗識別的氨基酸序列及表位構(gòu)象。通過用單抗對流感病毒HA的抗原表位進行精細分析,為研發(fā)新型重組疫苗和多表位疫苗提供理論指導(dǎo)。此外,為了探索H5N1病毒跨越種屬屏障直接從禽類感染人類的分子基礎(chǔ),我們又進行了10株人及野鳥H5N1分離株在人靶細胞上復(fù)制能力及拮抗人細胞因子等的差異研究。 首先,我們根據(jù)人H5N1病毒A/Beijing/01/03株的HA1基因編碼區(qū)984bp的序列,利用生物分析軟件Oligo6.0設(shè)計了17條引物(共16對),采用常規(guī)PCR方法,利用這些引物分別擴增出HA1的16個不同長度的重疊肽的基因片段。利用限制性內(nèi)切酶雙酶切,將16條不同長度的HA1基因片段克隆到pDisplay載體中,篩選陽性克隆并測序鑒定,構(gòu)建了16個重組質(zhì)粒pDisplay-HA1-1~10及pDisplay-HA1-1’~6’。測定16個真核表達重組質(zhì)粒的濃度及純度,轉(zhuǎn)染HeLa細胞,各HA1蛋白重疊肽段均獲得成功表達。將表達各HA1重組肽段的細胞制備成各HA1肽段抗原片,建立起間接免疫熒光檢測方法,用于抗原表位分析。 其次,我們制備了抗H5N1(A/Beijing/01/03株)的單克隆抗體和多克隆抗體并對其性質(zhì)進行研究。用甲醛滅活的病毒雞胚尿囊免疫動物三次后,對小鼠血清檢測出現(xiàn)特異性抗體者,取脾進行細胞融和實驗,有限稀釋克隆法篩選單克隆抗體細胞株,建立了12株穩(wěn)定分泌抗AIV抗體的雜交瘤細胞。對自行制備的12株單抗和車小燕研究員惠贈的18株單抗的免疫學特性如抗體效價、血凝抑制活性、中和效價、單抗對HA蛋白特異性的識別等進行了鑒定。結(jié)果顯示,應(yīng)用間接免疫熒光方法測定全部30株雜交瘤腹水效價均在320-20480之間;發(fā)現(xiàn)13株McAb對病毒有較高的血凝抑制活性;用單抗對表達的HA1全長肽段進行識別檢測,發(fā)現(xiàn)18株單抗對HA蛋白是特異性的;采用微量細胞培養(yǎng)中和試驗測定了18株抗HA1單抗,6株具有中和抗體活性,中和效價在1㑳52~1㑳2032之間。同時,用滅活病毒免疫小鼠,成功地制備出了高效價的鼠抗H5N1多克隆血清抗體。 第三,利用H5N1病毒特異性單抗及多克隆血清抗體采用間接免疫熒光法檢測表達的禽流感病毒HA蛋白重疊肽抗原,分析HA的抗原表位及優(yōu)勢抗原表位。將每株單抗分別與16個表達的HA1重疊肽段結(jié)合,確定單抗識別的肽段區(qū)域,并對單抗的識別表位特征進行分析。同樣方法,利用制備的多抗與表達的HA1各重疊肽段進行結(jié)合反應(yīng)性分析,確定HA蛋白上的優(yōu)勢抗原區(qū)域。初步分析確定3B5、3D1、3B2、M6、M3等18株單抗識別表位區(qū)域分別位于氨基酸殘基aa133-143,aa155-165,aa166-196,aa166-176,aa34-66及aa296-328之間,其中3B5、3D1、3B2、M6等單抗識別的表位為序列依賴型表位,M3和M7等具有中和活性的單抗所識別表位為構(gòu)象性中和表位。將18株單抗識別的抗原表位在HA分子一級和三級結(jié)構(gòu)上進行定位,確定了它們在三維HA中的位置。通過分析,初步確定HA1蛋白的優(yōu)勢抗原表位區(qū)為aa133-165 ,序列為IPKSSWSNHEASSGVSSACPYLGRPSFFRNVVW。這些結(jié)果為進一步了解HA抗原表位相關(guān)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了重要數(shù)據(jù),對探索流感病毒抗原變異規(guī)律和新型疫苗的研發(fā)具有一定的理論意義。 第四,對A/Beijing/01/03等10株人及野鳥源H5N1病毒在人體靶細胞上復(fù)制能力差異的分子機制進行了研究。首先進行了人及野鳥H5N1病毒分離株空斑滴度測定,又進行了10株分離株在人A549細胞上復(fù)制能力以及對人IFN和TNF等細胞因子的敏感性檢測,并對病毒基因組全序列進行分析。結(jié)果顯示,人H5N1病毒株跨越種屬屏障感染人可能與其在人體靶細胞的高效復(fù)制能力有著密切關(guān)系;初步確定NS1蛋白上三處氨基酸殘基的突變可能與病毒適應(yīng)人細胞復(fù)制有關(guān)。成功的構(gòu)建了人H5N1病毒(A/Vietnam/1194/2004)株NS1基因突變株,為H5N1病毒適應(yīng)并引起人類嚴重感染的分子生物學研究奠定了一定的基礎(chǔ)。 通過上述研究,獲得以下結(jié)果:1、成功地構(gòu)建了一批表達HA不同長度肽段的質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染LeLa細胞,獲得了真核細胞表達,制備了一批抗H5N1病毒的單克隆抗體,并對單抗進行了特性研究。這些肽段和單抗對研制甲型流感病毒特異診斷試劑具有重要的應(yīng)用價值;2、利用單抗和不同長度的HA肽段對HA上抗原表位分析初步證明,HA1上存在著血凝型、非血凝型和中和型等多種抗原表位,血凝型抗原表位主要為序列依賴性表位;3、通過構(gòu)象分析證明,中和型表位主要為構(gòu)象表位;4、通過優(yōu)勢抗原表位分析,確定HA1蛋白的優(yōu)勢抗原表位區(qū)為aa133-165,序列為IPKSSWSNHEASSGVSSACPYLGRPSFFRNVVW。這些結(jié)果為進一步了解HA抗原表位相關(guān)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究提供了重要數(shù)據(jù),對探索流感病毒抗原變異規(guī)律和新型疫苗的研發(fā)具有一定的理論意義。對A/Beijing/01/03等10株人及野鳥H5N1病毒在人體靶細胞上復(fù)制能力差異分子機制的初步分析發(fā)現(xiàn),人源H5N1病毒在人細胞上復(fù)制能力強,可能是H5N1病毒感染人類的前提。NS1蛋白效應(yīng)區(qū)上3處氨基酸殘基突變可能與病毒適應(yīng)人體復(fù)制相關(guān),這對進一步探索H5N1病毒的分子生物學致病機理提供了可參考的資料。
【圖文】：

1968 年毒株（H3N2）HA 分子的抗原表位結(jié)構(gòu)圖the solved structure of a 1968 strain of HA(H3 subtype，HA 由 329 氨基酸殘基組成的重鏈 HA1 和 175 個氨基酸構(gòu)成。在 HA 分子上通常確定有五個抗體結(jié)合表位：A（紅D（淺藍），E（深藍），均位于 HA1。蛋白上五個抗原表位區(qū)域（A-E）都已經(jīng)鑒定及序列測位。試驗及分析表明，可能由于抗體選擇壓力，病毒其他區(qū)域快，特別是優(yōu)勢表位突變最快。Mu oz等通表位內(nèi)氨基酸位點突變率的統(tǒng)計觀察來確定相關(guān)的變率分別為 0.053 ， 0.14 ， 0.037 ， 0 ， 0.09 ，推斷/99 HA蛋白上為占優(yōu)勢的表位，E表位為次優(yōu)勢表位�？乖儺惒≡w的典型范例,似乎有逃避免疫應(yīng)答的年造成 50 萬人死亡�？共《颈砻嫣堑鞍� HA 的抗體性，并且 HA 是流感疫苗的主要組分。但是 HA 的抗

17圖2 pDisplay載體結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The features and the multiple cloning site of pDisplay1.4 引物設(shè)計及合成根據(jù)人H5N1病毒株A/Beijing/01/03株的HA1基因編碼序列，真核表達載體pDisplay的基因圖譜和其多克隆酶切位點圖譜（圖2），利用生物分析軟件Oligo6.0確定上游和下游的酶切位點分別為SacⅡ和SalⅠ。設(shè)計17條引物（見表1，其中Primer 1和Primer 11為通用引物），擴增16種HA1蛋白相互重疊的基因序列。擴增引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，用無核酸酶水配制成濃度為20μM的儲存液，，-20℃保存?zhèn)溆谩?
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392.1

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本文編號：2564959