【摘要】：目的：通過構建ARG1基因真核表達載體PcDNA3.1-IE-ARG1,轉染293T細胞來研究ARG1基因的抗砷性。 方法：采用脂質體介導的轉染方法將PcDNA3.1-IE-ARG1轉染入293T細胞中,用激光共聚焦顯微鏡和real-timePCR方法進行ARG1基因表達鑒定；MTT法檢測48小時急性砷中毒時細胞的生存率；原子吸收分光光度法測定不同濃度(1.4、8μmol/L)砷作用于PcDNA3.1-IE-ARG1組、空載體組及未轉染組細胞24h后,細胞內砷含量及細胞分別在24小時、48小時的排砷量；用含NaAsO2濃度為0、4、8μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)三組細胞48小時,二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)法測定細胞內谷胱甘肽(GSH)含量及谷胱甘肽轉移酶(GST)活性,蛋白印記法測定細胞內多藥耐藥相關蛋白2(MRP2)的表達。 結果：PcDNA3.1-IE-ARG1成功轉入293T細胞中且表達良好；48小時急性砷中毒試驗顯示各組細胞生存率均明顯下降,存在劑量-效應依賴關系,隨著砷濃度的增加,各組細胞在各濃度下的生存率都逐漸降低；但PcDNA3.1-IE-ARG1組細胞在低濃度(砷濃度≤8μmol/L)砷作用下,生存率均明顯高于其它兩組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；用濃度為1、4、8μmol/L的NaAsO2作用細胞24小時,PcDNA3.1-IE-ARG1組細胞內砷含量明顯降低,24小時、48小時的排砷量明顯增高,與其它兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)；用濃度為0、4、8μmol/L的NaAsO2作用細胞48小時后,PcDNA3.1-IE-ARG1組細胞內GSH與GST的含量及MRP2蛋白表達明顯增高,與其它兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),且隨著砷作用劑量的增加GSH.GST及MRP2表達亦增加。 結論：ARG1基因在293T細胞中相對高表達后,提高了293T細胞對砷的耐受性。
【圖文】：

溶液轉化大腸桿菌DHS。感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取單克隆菌落作為模板，PCR產物在 1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，結果在 NDAmarkerZkb與1.2kb之間擴增出特異性條帶(見圖1)。1.2重組質粒的雙酶切鑒定及測序:為了鑒定含有ARGI基因開放閱讀的真核表達載體構建是否成功，我們將上述擴增出特異性條帶的菌落培養(yǎng)后提取質粒，經BamHI和EcoRI雙酶切后進行電泳，結果在DNAmarker大于 1.2kb處出現(xiàn)2條特異擴增條帶，分別與空載體PcDNA3.l一IE和ARGI基因開放閱讀框理論值(大小5.4kb左右和1532bP)進行比對，結果相符(見圖2)。將克隆進行雙向測序，結果顯示DNA序列與GenBank發(fā)表的ARGI基因開放閱讀序列完全一致(見附錄)。4。skb4.skbZkb 1.2kb2kb 1.2kb圖1質粒轉化菌的菌落PCR產物電泳圖圖2重組質粒雙酶切電泳圖2.PeDNA3.1一IE一ARGI在293T細胞中的表達及鑒定2.1形態(tài)學觀察PcDNA3.1一IE一ARGI轉染前后293T細胞為了解轉染目的基因后，是否影響細胞形態(tài)，我們在倒置顯微鏡觀察293T細胞形態(tài)變化

特異性條帶的菌落培養(yǎng)后提取質粒，經BamHI和EcoRI雙酶切后進行電泳，結果在DNAmarker大于 1.2kb處出現(xiàn)2條特異擴增條帶，分別與空載體PcDNA3.l一IE和ARGI基因開放閱讀框理論值(大小5.4kb左右和1532bP)進行比對，結果相符(見圖2)。將克隆進行雙向測序，，結果顯示DNA序列與GenBank發(fā)表的ARGI基因開放閱讀序列完全一致(見附錄)。4。skb4.skbZkb 1.2kb2kb 1.2kb圖1質粒轉化菌的菌落PCR產物電泳圖圖2重組質粒雙酶切電泳圖2.PeDNA3.1一IE一ARGI在293T細胞中的表達及鑒定2.1形態(tài)學觀察PcDNA3.1一IE一ARGI轉染前后293T細胞為了解轉染目的基因后，是否影響細胞形態(tài)，我們在倒置顯微鏡觀察293T細胞形態(tài)變化，結果293T細胞生活狀態(tài)下呈梭形、三角或多角形。轉染后細胞形態(tài)沒有明顯改變(見圖3一A、B、C)。由于重組質粒PcDNA3.1一IE一ARGI帶有增強型綠色熒光蛋白 (EGFP)，所以本研究通過激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP的表達來間接反映ARGI基因轉染情況。轉染24h后，重組質粒組細胞中可見特異性EGFP綠色熒光，且綠色熒光蛋白分布于細胞膜附近;空載體組綠色熒光蛋白分布于整個細胞(見圖3一D、E、F)，轉染率為70%以上。
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R346

【參考文獻】

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本文編號：2552333