【摘要】：目的：通過(guò)構(gòu)建ARG1基因真核表達(dá)載體PcDNA3.1-IE-ARG1,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞來(lái)研究ARG1基因的抗砷性。 方法：采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將PcDNA3.1-IE-ARG1轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中,用激光共聚焦顯微鏡和real-timePCR方法進(jìn)行ARG1基因表達(dá)鑒定；MTT法檢測(cè)48小時(shí)急性砷中毒時(shí)細(xì)胞的生存率；原子吸收分光光度法測(cè)定不同濃度(1.4、8μmol/L)砷作用于PcDNA3.1-IE-ARG1組、空載體組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞24h后,細(xì)胞內(nèi)砷含量及細(xì)胞分別在24小時(shí)、48小時(shí)的排砷量；用含NaAsO2濃度為0、4、8μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)三組細(xì)胞48小時(shí),二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)含量及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)活性,蛋白印記法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)的表達(dá)。 結(jié)果：PcDNA3.1-IE-ARG1成功轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中且表達(dá)良好；48小時(shí)急性砷中毒試驗(yàn)顯示各組細(xì)胞生存率均明顯下降,存在劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系,隨著砷濃度的增加,各組細(xì)胞在各濃度下的生存率都逐漸降低；但PcDNA3.1-IE-ARG1組細(xì)胞在低濃度(砷濃度≤8μmol/L)砷作用下,生存率均明顯高于其它兩組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；用濃度為1、4、8μmol/L的NaAsO2作用細(xì)胞24小時(shí),PcDNA3.1-IE-ARG1組細(xì)胞內(nèi)砷含量明顯降低,24小時(shí)、48小時(shí)的排砷量明顯增高,與其它兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；用濃度為0、4、8μmol/L的NaAsO2作用細(xì)胞48小時(shí)后,PcDNA3.1-IE-ARG1組細(xì)胞內(nèi)GSH與GST的含量及MRP2蛋白表達(dá)明顯增高,與其它兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),且隨著砷作用劑量的增加GSH.GST及MRP2表達(dá)亦增加。 結(jié)論：ARG1基因在293T細(xì)胞中相對(duì)高表達(dá)后,提高了293T細(xì)胞對(duì)砷的耐受性。
【圖文】：

溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHS。感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取單克隆菌落作為模板，PCR產(chǎn)物在 1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，結(jié)果在 NDAmarkerZkb與1.2kb之間擴(kuò)增出特異性條帶(見(jiàn)圖1)。1.2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定及測(cè)序:為了鑒定含有ARGI基因開(kāi)放閱讀的真核表達(dá)載體構(gòu)建是否成功，我們將上述擴(kuò)增出特異性條帶的菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后進(jìn)行電泳，結(jié)果在DNAmarker大于 1.2kb處出現(xiàn)2條特異擴(kuò)增條帶，分別與空載體PcDNA3.l一IE和ARGI基因開(kāi)放閱讀框理論值(大小5.4kb左右和1532bP)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果相符(見(jiàn)圖2)。將克隆進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果顯示DNA序列與GenBank發(fā)表的ARGI基因開(kāi)放閱讀序列完全一致(見(jiàn)附錄)。4。skb4.skbZkb 1.2kb2kb 1.2kb圖1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的菌落PCR產(chǎn)物電泳圖圖2重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖2.PeDNA3.1一IE一ARGI在293T細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定2.1形態(tài)學(xué)觀察PcDNA3.1一IE一ARGI轉(zhuǎn)染前后293T細(xì)胞為了解轉(zhuǎn)染目的基因后，是否影響細(xì)胞形態(tài)，我們?cè)诘怪蔑@微鏡觀察293T細(xì)胞形態(tài)變化

特異性條帶的菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后進(jìn)行電泳，結(jié)果在DNAmarker大于 1.2kb處出現(xiàn)2條特異擴(kuò)增條帶，分別與空載體PcDNA3.l一IE和ARGI基因開(kāi)放閱讀框理論值(大小5.4kb左右和1532bP)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果相符(見(jiàn)圖2)。將克隆進(jìn)行雙向測(cè)序，，結(jié)果顯示DNA序列與GenBank發(fā)表的ARGI基因開(kāi)放閱讀序列完全一致(見(jiàn)附錄)。4。skb4.skbZkb 1.2kb2kb 1.2kb圖1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的菌落PCR產(chǎn)物電泳圖圖2重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖2.PeDNA3.1一IE一ARGI在293T細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定2.1形態(tài)學(xué)觀察PcDNA3.1一IE一ARGI轉(zhuǎn)染前后293T細(xì)胞為了解轉(zhuǎn)染目的基因后，是否影響細(xì)胞形態(tài)，我們?cè)诘怪蔑@微鏡觀察293T細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果293T細(xì)胞生活狀態(tài)下呈梭形、三角或多角形。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯改變(見(jiàn)圖3一A、B、C)。由于重組質(zhì)粒PcDNA3.1一IE一ARGI帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (EGFP)，所以本研究通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)來(lái)間接反映ARGI基因轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染24h后，重組質(zhì)粒組細(xì)胞中可見(jiàn)特異性EGFP綠色熒光，且綠色熒光蛋白分布于細(xì)胞膜附近;空載體組綠色熒光蛋白分布于整個(gè)細(xì)胞(見(jiàn)圖3一D、E、F)，轉(zhuǎn)染率為70%以上。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2552333