【摘要】： 目的 收集臨床IVF剩余的正常受精胚胎、異常受精胚胎和植入前遺傳學診斷異常的胚胎進行囊胚培養(yǎng),分離培養(yǎng)新的正常hESCs以及疾病模型hESCs;研究早期胚胎、干細胞的自發(fā)分化和誘導分化過程中細胞骨架和線粒體的形成和分布特征,分析細胞骨架的變化以及線粒體數(shù)量形態(tài)的變化與胚胎干細胞分化的關(guān)系。 材料和方法 hESCs系的建立:胚胎來源于浙江大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖中心,患者簽署了知情同意書后,使用其沒有凍存價值的正常受精的廢棄胚胎以及0PN,1PN,3PN和植入前遺傳學診斷為異常的廢棄胚胎。選擇受精后5-7天內(nèi)發(fā)育到擴張囊胚(expandedblastoeyst)的胚胎,用于內(nèi)細胞團(Inner cell mass,ICM)的分離。使用機械法、免疫外科、全囊胚貼壁法分離內(nèi)細胞團。隨后進行ICM增殖物的離散、傳代和擴增,凍存hESCs,并進行鑒定。 hESCs的鑒定:堿性磷酸酶活性染色、對細胞是否表達干細胞標志物SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,OCT-4進行免疫熒光鑒定、采用RT-PCR檢測hESCs中干細胞特異性基因Nanog,TDGF1,Sox2,EBAF,Thy-1,FGF4,Rex1等7個基因的表達情況,進行hESCs核型分析以及hESCs的三胚層體外分化實驗。 線粒體和細胞骨架的動態(tài)觀察:超排卵后收集不同發(fā)育階段的卵母細胞和胚胎;常規(guī)hESCs培養(yǎng),進行類胚體途徑的ES自發(fā)分化;常規(guī)小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)和增殖與傳代。參照Huang(2006)的RA誘導進行mES定向分化。常規(guī)免疫熒光技術(shù)進行線粒體(Mitotrack Red)和細胞骨架(FITC conjugated mouse anti-β-tubulin)的熒光染色。透射電鏡的切片染色按照常規(guī)方法進行。 結(jié)果 1.從正常受精胚胎中分離了兩株的hESCs分別被命名為ZJ01和ZJ02,從非正常受精胚胎分離了四株hESCs分別被命名為ZJ03、ZJ04、ZJ05以及ZJ06。所有干細胞呈典型的集落樣生長,集落邊緣光滑清晰,細胞排列緊密,細胞具有較高的核質(zhì)比和2-3個明顯的核仁;對干細胞進行鑒定,發(fā)現(xiàn)ZJ01,ZJ02,ZJ03,ZJ04干細胞的堿性磷酸酶活性染色強陽性,且均表達干細胞標志物SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,OCT-4;RT-PCR檢測表明,這兩株干細胞表達干細胞特異性基因Nanog,TDGF1,Sox2,EBAF,Thy-1,FGF4和Rex1;核型分析結(jié)果表明,ZJ01,ZJ02,ZJ04干細胞系為正常的二倍體,ZJ03為4號染色體三體的干細胞,可作為疾病(染色體病)模型干細胞;體外分化實驗證明,上述干細胞系具有向三胚層分化能力。 2.從合子到八細胞期,卵裂球內(nèi)線粒體基本呈現(xiàn)均勻分布,沒有極化現(xiàn)象;從桑椹胚到囊胚,卵裂球內(nèi)細胞骨架結(jié)構(gòu)明顯,且線粒體的分布也從原來的均勻分布到極化分布; 4.未分化的干細胞中,微管蛋白及微管均均勻分布,干細胞開始發(fā)生分化后,微管蛋白的表達量及微管數(shù)量顯著增加,隨著分化程度的深入,微管結(jié)構(gòu)出現(xiàn);未分化的干細胞中,線粒體亦均勻分布于細胞質(zhì)中,發(fā)生分化后,線粒體出現(xiàn)極化分布現(xiàn)象,明顯分布在細胞的一端;類胚體中微管結(jié)構(gòu)明顯,線粒體集中分布在微管周圍;RA誘導后,分化細胞的類型呈現(xiàn)不同的微管和線粒體的分布特性。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建兩株正常hESCs和四株異常受精的疾病模型hESCs。 2.在干細胞以及早期胚胎細胞分化開始前,細胞質(zhì)足夠的細胞骨架蛋白以及細胞骨架結(jié)構(gòu)的形成是細胞分化的必要前提;在不同胚層的分化過程中,細胞骨架分布模式具有特殊性,細胞骨架是細胞形態(tài)的決定因素,可能決定細胞分化方向,線粒體的分布模式能推斷細胞分化的方向。
【圖文】：

在胚層分化過程中，不同胚層的分化過程中線粒體的分布模式具有一定的規(guī)律.根據(jù)我們的研究結(jié)果，現(xiàn)提出線粒體體現(xiàn)細胞分化的兩個基本模型(圖3.28;圖3.29).模型一:分化為內(nèi)胚層的細胞中，線粒體集中分布在細胞核的一端，極化分布明顯;模型二:分化為中胚層的細胞中，線粒體明顯分布在細胞核的兩端，亦呈明顯的極化分布(兩極分布).這種線粒體的分布特征，能墓本推斷胚層分化的方向.哪驪圖3.28干細胞類胚體途徑分化模型一:線粒體沿著細胞骨架，呈聚集狀分布于核的一端.這類分化細胞將來可能分化為內(nèi)胚層細胞

圖1.4機械法分離的ICM在HEF上貼壁生長的原代克隆增殖5天的ICM，原代克隆混有的TE較少;增殖7天的ICM，原代克隆呈巢式生長，與周圍飼養(yǎng)層細胞分界圖1.5新分離的2株hES細胞，10Ox免疫外科法分離ICM，以MEF為飼養(yǎng)層建立的hES一zJ01;(B
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【共引文獻】

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1 王克華,李娟,張琦,董云玲;胚胎移植前遺傳學診斷及其對助孕技術(shù)的影響[J];國外醫(yī)學.婦產(chǎn)科學分冊;2001年02期

2 金帆,黃荷鳳,葉英輝,邢來鳳;單細胞的DOP—PCR—CGH分析[J];中國計劃生育學雜志;1999年08期

3 徐晨明,金帆,黃荷鳳,陶冶,葉英輝;全基因組擴增在DMD植入前遺傳學診斷中的可行性研究[J];中國計劃生育學雜志;2001年05期

4 Jason IE Bruce;;Plasma membrane calcium pump regulation by metabolic stress[J];World Journal of Biological Chemistry;2010年07期

5 邢蘭鳳;許小萍;;植入前遺傳學診斷的護理[J];中國實用護理雜志;2006年17期

6 徐晨明 ,金帆 ,黃荷鳳 ,陶冶 ,葉英輝;Single Cell Analysis of Dystrophin and SRY Gene by Using Whole Genome Amplification[J];Reproduction & Contraception;2001年03期

7 王秀珍,韓志強;花粉中微管與花粉管伸長及其胞質(zhì)顆粒運動的關(guān)系[J];作物學報;1995年02期

8 李汶,盧光t;植入前遺傳學診斷的原理、方法及適應癥[J];遺傳;2002年03期

9 金帆;SINGLE CELL DEGENERATE OLIGONUCLEOTIDE PRIMER-PCR AND COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION WITH MODIFIED CONTROL REFERENCE[J];Journal of Zhejiang University Science;2001年03期

10 徐晨明,金帆,錢羽力,葉英輝,朱依敏,黃荷鳳;應用熒光原位雜交技術(shù)進行植入前胚胎染色體診斷的價值[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2004年07期

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1 張云山;性連鎖遺傳病和HLA基因型的植入前遺傳學診斷[D];天津醫(yī)科大學;2010年

2 葉小群;肺癌干細胞的分離鑒定及線粒體能量代謝特性的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2011年

3 岳順利;單卵裂球建立小鼠胚胎干細胞系的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2010年

4 黎青;DMD基因診斷體系建立、應用和羊水iPSCs構(gòu)建[D];南方醫(yī)科大學;2013年

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1 姚寧;不同方法生產(chǎn)的牛早期胚胎干擾素-tau基因mRNA表達活性分析[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2005年

2 肖驤;兩種細胞骨架及其相關(guān)馬達蛋白在日本沼蝦精子發(fā)生過程中作用的分子機制[D];浙江大學;2007年

3 孫博;人廢棄胚胎群體培養(yǎng)及胚胎干細胞系的建立[D];鄭州大學;2013年

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本文編號：2549847