【摘要】： 近年來,國際上逐步發(fā)展起了一種新的基因疫苗載體系統,稱為復制型DNA疫苗,克服了常規(guī)DNA疫苗免疫力低下、安全方面不能保障的缺陷,同時又保留了DNA疫苗穩(wěn)定、低成本的優(yōu)點,因而成為開發(fā)治療性疫苗最好的技術途徑之一。 本研究室前期自主開發(fā)了基于塞姆利基森林病毒SFV的復制子DNA疫苗載體系統(可復制型DNA疫苗),并用于腫瘤疫苗及乙肝疫苗等新型治療性基因疫苗的研究。所謂可復制型DNA疫苗,是在RNA復制子疫苗基礎上發(fā)展演化而來的一種新型DNA疫苗系統。與常規(guī)DNA疫苗相比,可復制型DNA疫苗利用RNA復制酶,在細胞中具有自我復制能力,介導RNA復制子在細胞質中進行大量自我復制,因此外源基因可以得到高效表達。同時RNA大量自我復制過程中,產生的雙鏈RNA是強效天然免疫佐劑,使可復制型DNA疫苗免疫效力遠遠高于常規(guī)DNA疫苗,用量可降低到傳統DNA疫苗的100倍以下。再有,該疫苗的自我復制、轉錄表達均發(fā)生于細胞質中,最終會誘導被轉染細胞凋亡,從而消除了與宿主細胞基因組整合的危險性,大大提高了基因疫苗的安全性。而且,這種疫苗以類似脈沖的形式刺激機體免疫系統,能夠有效克服免疫耐受。 為了進一步提高復制子DNA疫苗抗原的遞送效率和免疫效果,本研究將復制子載體包裝成為甲病毒顆粒樣疫苗,同時還對所制備顆粒進行DC靶向化改造。病毒顆粒這種疫苗形式,除了具備復制子疫苗的全部優(yōu)點外,還可以使其包裝的復制子DNA免受核酸酶的降解,增強抗原進入細胞的效率,充分發(fā)揮病毒樣顆粒本身的免疫學特性。同時,通過對這種重組的甲病毒顆粒疫苗進行DC靶向化改造,在體內選擇性感染DC細胞,進一步增強DC細胞對抗原的吞噬、加工和遞呈功能,從而提高疫苗激發(fā)特異性免疫應答的效果,最終提高疫苗的免疫效力。 首先,本研究以基于SFV的含有紅綠熒光蛋白報告基因的復制子DNA表達載體pSCK-EGFP-IRES-dsRED為基礎,通過與輔助載體pSHCAR共轉染,由pSHCAR提供結構蛋白,制備表達紅綠熒光蛋白報告基因的重組病毒顆粒,并驗證其表達能力。同時,通過實驗,比較單獨pSCK-EGFP-IRES-dsRED質粒和所制備的含有紅綠熒光蛋白報告基因的重組病毒顆粒的表達能力。通過調整共轉染時復制子表達載體和輔助載體的比例,并計算病毒滴度,初步摸索甲病毒包裝的優(yōu)化實驗條件。通過檢測報告基因的表達情況初步可以看出重組病毒顆粒表達效率比單獨轉染pSCK-EGFP-IRES-dsRED質粒要高,所制備的重組病毒滴度能夠達到6.5×105IU/mL。通過對比在共轉染時復制子DNA表達載體和輔助載體的摩爾比為1:1或者是質量比為1:1,經過檢測紅綠熒光蛋白報告基因,得出的實驗結果是:共轉染時可復制型DNA表達載體和輔助載體的質量比為1:1時,能得到更高滴度的病毒顆粒。 在上述研究基礎上,進一步對本室前期構建的HBV復制子DNA疫苗pSCK-HBV-Fc-GPI-IRES-GM/B7進行病毒樣顆粒化包裝研究。將pSCK-HBV-Fc-GPI-IRES-GM/B7質粒與輔助載體共轉染BHK21細胞,收集細胞培養(yǎng)上清,制備HBV復制子病毒顆粒疫苗,并通過流式細胞儀和免疫熒光檢測HBV復制子病毒顆粒疫苗的表達能力。初步結果可以看出,HBV復制子病毒顆粒疫苗能夠在細胞中表達,經病毒滴度測定,制備的重組病毒滴度達到1.5×105 IU /mL。 然后,我們借鑒國外的最新研究,以基于SFV(塞姆利基森林病毒)的可復制型病毒顆粒疫苗為基礎,對其進行DCs靶向化研究。主要工作就是對基于SFV的輔助載體pSHCAR進行DC靶向化改造,使其輔助包裝的病毒顆粒能特異性地結合DC表面分子DC-SIGN,從而實現病毒顆粒疫苗對DC細胞的特異性感染,進一步提高抗原遞呈效率。最后對改造后的輔助載體進行表達和包裝能力的初步驗證。初步結果證實:改造后的輔助載體pSHCART具有較好的表達能力,通過RT-PCR檢測手段證明改造后的輔助載體具有包裝并形成病毒的能力,并且通過與復制子表達載體共轉染能提高復制子表達載體的表達率。 為了進行重組甲病毒顆粒體外DC靶向化實驗研究,本實驗還構建了能夠穩(wěn)定表達DC-SIGN分子的BHK21細胞系。通過構建真核表達載體pIRES-neo-DC-SIGN,將重組質粒轉染BHK21細胞,以G418進行陽性克隆的篩選,通過有限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達DC-SIGN分子的BHK21細胞系,利用流式細胞儀、Western印跡及免疫熒光法檢測DC-SIGN分子的表達,最終成功構建了能穩(wěn)定表達人DC-SIGN分子的BHK21細胞系,為接下來DC靶向化重組甲病毒顆粒體外實驗研究奠定了基礎。 該DC靶向可復制型甲病毒顆粒疫苗載體系統的最終研究成功,將在“顆粒化、內源化、高效化、靶向化”遞呈抗原方面,具有不可比擬的技術優(yōu)勢。其應用價值和潛力,有待于進一步研究驗證。
【圖文】：

第一部分 基于可復制型甲病毒顆粒的 HBV 疫苗制備2 含有報告基因的重組病毒感染細胞后的流式細胞儀及免疫熒光分析結果重組病毒感染 24h 后的 BHK21 細胞，pSCK-EGFP-IRES-dsRED 表達紅綠熒光蛋白報告基因，收集細胞直接進行流式細胞儀檢測，流式檢測后將細胞滴片進行免疫熒光檢測，重組病毒的表達效率為 28.03%，參見圖 1.2 所示。

一部分 基于可復制型甲病毒顆粒的 HBV 疫苗重組病毒滴度的初步確定和重組病毒不同條件下生產的效率1 重組病毒滴度的測定結果為了測得所制備的重組病毒的滴度，根據紅綠熒光蛋白報告基因計數法進度測定，初步確定制備的重組病毒的滴度。經過計算不同比例稀釋的重組病清感染細胞后的表達效率，重組病毒共表達紅綠熒光蛋白的效率分別.03%、11.42%和 1.19%，，分別計算病毒的滴度，然后取其平均值，計算出所的表達紅綠熒光蛋白報告基因的病毒滴度為 6.5×105IU/mL。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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