【摘要】：旋毛蟲病是一種嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲病,其病原體為旋毛形線蟲[Trichinella spiralis(Owen,1835)Railliet,1895],主要因生食或半生食含有旋毛蟲幼蟲的豬肉及其他動(dòng)物肉類而感染,臨床上在急性期有持續(xù)性高熱、眼瞼和面部水腫、全身性肌肉酸痛、過敏性皮疹、血中嗜酸性粒細(xì)胞增多等變態(tài)反應(yīng)性表現(xiàn),重癥患者可因并發(fā)癥而死亡。國際旋毛蟲病委員會(huì)(International Commission on Trichinellosis,ICT)在1995-1997年間報(bào)道1萬多例病人,現(xiàn)已被列入再度肆虐的疾病(re-emerging disease)。目前,由于旋毛蟲不能在體外傳代培養(yǎng),阻礙了其侵入宿主分子機(jī)制、感染宿主后腸道排蟲反應(yīng)分子機(jī)制、抗旋毛蟲藥物篩選及旋毛蟲疫苗研制等的研究,因此,旋毛蟲肌幼蟲體外培養(yǎng)的研究就顯得尤其重要。 本研究將旋毛蟲肌幼蟲在不同液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),觀察幼蟲蛻皮時(shí)間及培養(yǎng)不同時(shí)間后蛻皮幼蟲的比例,并對未蛻皮肌幼蟲長度進(jìn)行測量:觀察液體培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+T84細(xì)胞)、半固體培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+瓊脂糖、完全培養(yǎng)基+瓊脂糖+T84細(xì)胞)對幼蟲蛻皮的影響;在半固體培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+瓊脂糖+Caco-2細(xì)胞)中觀察幼蟲經(jīng)不同活化物處理后對其蛻皮的影響,并比較2種腸上皮細(xì)胞對幼蟲蛻皮的影響。 材料與方法 1.旋毛蟲蟲種、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞系本研究中所用的旋毛蟲為旋毛蟲河南株(Trichinella spiralis,T1),昆明小鼠傳代保種,人工消化法和貝氏法收集純凈的旋毛蟲肌幼蟲;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康雄性6 w齡昆明小鼠和Sprague Dawley(SD)大鼠;所用細(xì)胞為人結(jié)腸癌細(xì)胞系(human colonic carcinoma cell line)T84和Caco-2細(xì)胞。 2.大鼠腸內(nèi)容物與小鼠膽汁的制備①將禁食8 h的大鼠剖殺后,將小腸用5 ml含抗生素的生理鹽水沖洗,1 200 g離心10 min除去大的碎片,上清液即為腸內(nèi)容物,用生理鹽水1:2稀釋后-20℃?zhèn)溆?用前再用生理鹽水1:10稀釋;②將禁食8 h的惺篤噬焙?取出完整膽囊,收集膽汁后-20℃?zhèn)溆?用前用生理鹽水1:20稀釋。 3.旋毛蟲肌幼蟲在培養(yǎng)液中培養(yǎng)①將新鮮肌幼蟲分別在生理鹽水、PBS、RPMI-1640培養(yǎng)液和含5%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)RPMI-1640培養(yǎng)液等4種液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng);②從培養(yǎng)第12 h開始,每隔2 h在倒置顯微鏡下觀察并記錄各組培養(yǎng)液中肌幼蟲開始蛻皮的時(shí)間;③每24 h從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶,混勻后吸取肌幼蟲鏡下觀察并計(jì)數(shù)蛻皮的幼蟲并拍照;選取約15條兩端均未見明顯蛻皮的幼蟲拍照后測量長度。 4.旋毛蟲肌幼蟲在3種不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)將新鮮的肌幼蟲在大鼠腸內(nèi)容物中孵育后分別在完全培養(yǎng)基(含10%FBS DMEM/F12培養(yǎng)基)+T84細(xì)胞、半固體培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+1.75%瓊脂糖)、半固體培養(yǎng)基+T84細(xì)胞中培養(yǎng)24 h,鏡下觀察并計(jì)數(shù)1期(未蛻下完整表皮的幼蟲)及2～4期(蛻下完整表皮的幼蟲)的幼蟲。 5.不同活化物對培養(yǎng)幼蟲蛻皮的影響將新鮮的肌幼蟲分別在生理鹽水、RPMI-1640培養(yǎng)液、大鼠腸內(nèi)容物或小鼠膽汁孵育后,懸浮至半固體培養(yǎng)基(含10%FBSDMEM培養(yǎng)基+1.75%瓊脂糖),并覆蓋至Caco-2細(xì)胞層進(jìn)行培養(yǎng),24 h后鏡下觀察并計(jì)數(shù)1期及2～4期的幼蟲。 6.腸上皮細(xì)胞對培養(yǎng)幼蟲蛻皮的影響在半固體培養(yǎng)基中觀察T84和Caco-2細(xì)胞對培養(yǎng)幼蟲蛻皮的影響。 結(jié)果 1旋毛蟲肌幼蟲開始蛻皮時(shí)間的觀察在37℃5%CO_2條件下,肌幼蟲在RPMI-1640培養(yǎng)液、PBS、含5%FBS RPMI-1640培養(yǎng)液及生理鹽水中開始蛻皮的時(shí)間分別為15 h、19 h、23 h及37 h,蛻皮多數(shù)從幼蟲尾端開始。 2旋毛蟲肌幼蟲活動(dòng)性和蛻皮情況的觀察旋毛蟲肌幼蟲接種至培養(yǎng)液時(shí)非�；钴S,做伸展和卷曲運(yùn)動(dòng),在生理鹽水和PBS中培養(yǎng)3 d活動(dòng)性即明顯下降,5 d后基本不活動(dòng),在含5%FBS RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)至21 d時(shí)部分蟲體仍有活動(dòng);幼蟲在生理鹽水和PBS中僅蛻皮1層,在RPMI-1640培養(yǎng)液中可蛻皮1～4層,在所觀察的5 378條肌幼蟲中,蛻皮1～4層的幼蟲數(shù)分別是3 386條(62.96%)、1 377條(25.60%)、71條(1.32%)及14條(0.26%);幼蟲在含5%FBS RPMI-1640培養(yǎng)液中可蛻皮1～2層,分別占觀察幼蟲數(shù)的66.78%(3699/5539)及0.45%(25/5539)。 3.未蛻皮肌幼蟲長度變化的觀察在RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)1～21 d的未蛻皮
【圖文】：

下觀察細(xì)胞層和接種幼蟲情況，均在37℃5%co:培養(yǎng)箱培養(yǎng);24h后在鏡下別計(jì)數(shù)1期和2碎期幼蟲數(shù)。13統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和圖表的繪制，應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、因素方差分析(ANOVA)、卡方檢驗(yàn)和趨勢性檢驗(yàn)等方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)析，檢驗(yàn)水平為a=0.05。結(jié)果旋毛蟲肌幼蟲蛻皮時(shí)間的觀察在37，，C5%Cq條件下，肌幼蟲在RPMI-1640培養(yǎng)液、PBS、含5%FBSMI一1640培養(yǎng)液及生理鹽水中蛻皮的時(shí)間分別為15h(見圖l)、19h(見圖2)、h及37h，蛻皮多數(shù)從蟲體尾端開始。

旋毛蟲肌幼蟲在R護(hù)加n.1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)sd蛻4層皮(4oox)
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R383

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2526130