【摘要】： 瘧疾是蚊媒傳播的一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的熱帶傳染病,在全世界有很高的發(fā)病率和致死率。疫苗是控制瘧疾發(fā)病和阻止其傳播的有效的方法,減毒子孢子疫苗雖然能夠誘導(dǎo)宿主有效的抗瘧原蟲(chóng)反應(yīng),但是因?yàn)椴牧蟻?lái)源等條件的限制而難以應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)。因而有效的亞單位疫苗的研制仍然是目前瘧疾疫苗研究的重點(diǎn),對(duì)紅前期瘧原蟲(chóng)免疫機(jī)制的深入研究對(duì)紅前期亞單位疫苗的設(shè)計(jì)具有重要的指導(dǎo)意義。 DC作為體內(nèi)重要的抗原遞呈細(xì)胞,是架接宿主紅前期特異天然免疫及適應(yīng)性免疫的橋梁。最近的研究表明,感染瘧原蟲(chóng)的按蚊叮咬宿主后,瘧原蟲(chóng)子孢子侵入宿主皮下,部分子孢子可以進(jìn)入毛細(xì)淋巴管,甚至可見(jiàn)少量子孢子在進(jìn)入DC后仍可以進(jìn)行一段時(shí)間的發(fā)育,而該部位的DC在啟動(dòng)紅前期特異的CD8+T細(xì)胞的免疫反應(yīng),參與清除感染瘧原蟲(chóng)的肝細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。然而,進(jìn)入毛細(xì)淋巴管中的子孢子是主動(dòng)侵入DC還是被DC吞噬,及其對(duì)DC成熟誘導(dǎo)的作用和機(jī)制仍不清楚,對(duì)其機(jī)制的深入研究對(duì)闡明DC在紅前期保護(hù)性免疫的產(chǎn)生中的作用具有重要的意義。 本研究首先通過(guò)構(gòu)建約氏瘧原蟲(chóng)子孢子與小鼠骨髓來(lái)源DC(bone marrow-dendritic-cells,BMDC)體外共培養(yǎng)平臺(tái),然后利用熒光顯微鏡技術(shù)觀(guān)察子孢子與DC之間的相互作用,檢測(cè)子孢子是否主動(dòng)侵入DC;其次利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)對(duì)應(yīng)時(shí)段DC的共刺激分子的變化情況;最后轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pFLAG-CMV8-CSP至DC中,流式檢測(cè)其對(duì)相關(guān)共刺激分子的影響,研究子孢子與DC相互作用及初步探討其分子機(jī)制。研究主要包括兩個(gè)方面: 一、子孢子誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源DC成熟: 1、子孢子與小鼠骨髓來(lái)源DC共培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀(guān)察:分離并誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓DC,第7天后與EGFP-BY265子孢子共培養(yǎng)2h、4h和24h后,熒光顯微鏡觀(guān)察子孢子與DC的作用情況,發(fā)現(xiàn)大部分子孢子可以侵入DC,24h后瘧原蟲(chóng)為類(lèi)似肝期裂殖體的形態(tài),說(shuō)明子孢子可以侵入DC,并在DC內(nèi)進(jìn)行發(fā)育。 2、侵入的子孢子誘導(dǎo)DC成熟:子孢子與DC共培養(yǎng)2h、4h和24h后檢測(cè)DC表面成熟相關(guān)共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表達(dá)情況。可見(jiàn)2h時(shí),MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表達(dá)與正常DC對(duì)照組相似,無(wú)明顯變化。4h時(shí),加入子孢子的實(shí)驗(yàn)組MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表達(dá)較對(duì)照組有所上調(diào)。24h時(shí),MHC-II、CD80和CD86的表達(dá)上調(diào)比4h時(shí)更明顯,基本達(dá)到LPS的陽(yáng)性對(duì)照組的誘導(dǎo)水平。說(shuō)明侵入的子孢子可以誘導(dǎo)DC成熟,從而為激活紅前期特異的CD8+T細(xì)胞的反應(yīng)提供重要的前提條件。 二、轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8-CSP誘導(dǎo)DC成熟: 環(huán)子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)是瘧原蟲(chóng)子孢子主要的表面蛋白。自然感染情況下,子孢子在CSP和TRAP的介導(dǎo)下,能主動(dòng)侵入KC,并躲藏于納蟲(chóng)空泡內(nèi),避免吞噬溶酶體內(nèi)各種酶對(duì)子孢子的殺傷作用。位于納蟲(chóng)空泡內(nèi)子孢子表面蛋白CSP在pexel功能域的作用下,能轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞漿內(nèi),推測(cè)CSP可能參與入侵的子孢子對(duì)DC成熟的誘導(dǎo)。 我們首先構(gòu)建了pFLAG-CMV8-CSP重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染DC后24h,熒光顯微鏡下觀(guān)察計(jì)算轉(zhuǎn)染效率,達(dá)到40%以上,然后,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面的CD80和MHC-Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8-CSP重組質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV8空質(zhì)粒對(duì)照組相比,CD80表達(dá)明顯上調(diào),但是MHC-Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)無(wú)明顯變化。說(shuō)明進(jìn)入胞漿內(nèi)的CSP可以誘導(dǎo)DC成熟,但可能并非通過(guò)MHC-Ⅱ類(lèi)分子介導(dǎo)的途徑。 本研究成功構(gòu)建了約氏瘧原蟲(chóng)子孢子與小鼠DC相互作用的體外研究平臺(tái),這為進(jìn)一步研究子孢子與DC的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。利用這個(gè)平臺(tái)研究發(fā)現(xiàn),子孢子可以侵入DC并在其胞內(nèi)進(jìn)行發(fā)育,并且侵入的子孢子能夠誘導(dǎo)DC的成熟。我們將pFLAG-CMV8-CSP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DC后,發(fā)現(xiàn)子孢子同樣能夠誘導(dǎo)DC的成熟,說(shuō)明侵入DC的子孢子CSP可以轉(zhuǎn)移至胞漿內(nèi)誘導(dǎo)DC的成熟。這為更好地解釋DC與子孢子之間的相互關(guān)系,并進(jìn)一步研究DC在瘧原蟲(chóng)紅前期天然免疫的作用和分子機(jī)制,以及設(shè)計(jì)基于DC的瘧疾紅外期疫苗奠定了重要的基礎(chǔ)。
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士畢業(yè)論文，1μl FITC 標(biāo)記抗小鼠 IgG2b，0.8μl PE 標(biāo)記抗小2b，溫和混勻后，冰上孵育 30min，，用 1ml 4℃流式緩，重復(fù)洗滌一次后 100μl 流式緩沖液重懸沉淀細(xì)胞結(jié) 果度 BMDC天，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞表面有短小針狀突起，呈現(xiàn)典型細(xì)胞表面 CD11c 表達(dá)情況，可見(jiàn)細(xì)胞高表達(dá) CD1

A: 2h ; B: 4h ; C: 24h圖 1-2：子孢子與 DC 共培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀(guān)察熒光顯微鏡(×400)Fig1-2: Morphlogy of DCs and sporozoites after co-cultureddetected with fluorescence microscope(×400)三、侵入的子孢子誘導(dǎo) DC 表面共刺激分子及 MHC-Ⅱ類(lèi)分子的上調(diào)子孢子與 DC 共培養(yǎng) 2h、4h 和 24h 后檢測(cè) DC 表面 MHC-Ⅱ、CD80 和 CD86 的表達(dá)水平。可見(jiàn) 2h 時(shí)，MHC-Ⅱ、CD80 和 CD86 的表達(dá)與正常 DC(medium 組)相似，無(wú)明顯變化。4h 時(shí)，加入子孢子的 DC (SP 組)MHC-Ⅱ、CD80 和 CD86 的表達(dá)較 medium對(duì)照組有所上調(diào)。較 4h 時(shí)相比，24h 時(shí) DC 表面 MHC-Ⅱ類(lèi)分子、CD80 和 CD86 的表達(dá)上調(diào)更為明顯，基本達(dá)到 LPS 刺激的陽(yáng)性對(duì)照組的誘導(dǎo)水平(圖 1-3)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2518701