【摘要】： 免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily,IgSF)成員CD226分子是一種廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞膜表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白,在2000年第七屆國際人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組大會上獲得新的CD命名。此前,該分子被稱為“T細(xì)胞譜系特異性活化抗原1(T lineage- specific activation antigen 1,TLiSA1)”、“血小板與T細(xì)胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1,PTA1)”和“DNAX輔助分子1(DNAX accessory molecule-1,DNAM-1)”。 人CD226基因于1996年克隆成功,位于染色體18q22.3,其cDNA全長2664bp,開放讀框編碼336個氨基酸,其基因存在單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)。小鼠CD226基因由我室于2002年成功克隆,位于染色體18 E4,除了cDNA全長為2487bp的原型分子以外,還存在三種異型。完整的CD226分子由胞膜外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成,分子量為65~67 kDa,胞膜外區(qū)有2個IgSF V樣結(jié)構(gòu)域和潛在的糖基化位點(diǎn),胞漿區(qū)有磷酸化及與信號分子相互作用的位點(diǎn)。不同種屬的CD226分子在核苷酸水平和氨基酸水平均高度同源,蛋白結(jié)構(gòu)也十分相似,是一個在進(jìn)化上是一個相對保守的分子,提示該分子在機(jī)體免疫應(yīng)答過程和其他生物學(xué)功能中可能扮演了極為重要的角色。此外,CD226分子與CD96以及其他Nectin和Nectin樣分子(Nectin-like molecule,Necl)有較高的同源性。 CD226廣泛表達(dá)于T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NK T細(xì)胞、活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨核/血小板譜系、單核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、某些B細(xì)胞亞群、部分造血干細(xì)胞和肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面,在免疫系統(tǒng)以外則分布于海馬和小腦皮質(zhì)的神經(jīng)突觸部位。2003年,人CD226的兩種配體鑒定成功,分別是CD112/Nectin-2和CD155/Necl-5/PVR(脊髓灰質(zhì)炎病毒受體)。CD226與其配體的相互作用參與CTL和NK細(xì)胞的活化、分化和細(xì)胞毒作用,調(diào)節(jié)CD4+ T細(xì)胞的增殖和分化,介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與其他細(xì)胞的黏附,促進(jìn)血小板的活化與聚集,參與造血調(diào)控,介導(dǎo)肥大細(xì)胞的脫顆粒作用,參與NK T細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的抗凋亡作用、樹突狀細(xì)胞的成熟、免疫突觸和神經(jīng)突觸的形成,并與腫瘤、自身免疫性疾病、移植排斥及病毒感染等疾病密切相關(guān)。 人CD226除以膜型(mCD226)的形式表達(dá)在細(xì)胞膜表面外,還以可溶型(sCD226)的形式存在于血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清中。前期小規(guī)模臨床標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn),在腫瘤和多種自身免疫性疾病患者的血清中,sCD226的水平均顯著高于正常人,但是目前關(guān)于CD226與臨床疾病的研究僅限于膜型和/或可溶型CD226的表達(dá)及其基因SNP與疾病的關(guān)系,而CD226在腫瘤及自身免疫性疾病中的作用和可能的分子機(jī)制尚不清楚。 本研究首先制備和鑒定了一批抗人IgG Fc段、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase,GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein,MBP)和硫氧化還原蛋白(thioredoxin,Trx)等常用標(biāo)簽蛋白(tag)的單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb),在此基礎(chǔ)上建立或改良了定量檢測GST、Fc、MBP和Trx或其融合蛋白的雙抗體夾心ELISA試劑盒,敏感性分別達(dá)到了1.2、15.6、1和0.4 ng/ml。應(yīng)用Fc ELISA試劑盒檢測上清中hCD226-Fc水平的方法,克隆化了高水平分泌該融合蛋白的CHO-hCD226-Fc細(xì)胞株,大量制備細(xì)胞培養(yǎng)上清,并用抗Fc mAb標(biāo)記的Sepharose 4B親和層析柱純化了hCD226-Fc融合蛋白,用SDS-PAGE、Western blot和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)鑒定其純度和生物學(xué)活性,以此作為人sCD226 ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品以及體外殺傷實(shí)驗(yàn)中模擬天然sCD226作用的試劑。另外,還對我室前期研制的定量檢測人sCD226的雙抗體夾心ELISA試劑盒進(jìn)行了改良。 應(yīng)用條件優(yōu)化后的ELISA試劑盒檢測了259例腫瘤患者(包括消化、呼吸、血液、婦科、骨骼、神經(jīng)系統(tǒng)等多種來源的腫瘤)及129例正常人血清中sCD226的水平,發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中sCD226的水平(0.2-60 ng/ml,中位數(shù)11.5 ng/ml)明顯高于正常人(0.1-23 ng/ml,中位數(shù)6.3 ng/ml,P0.001);而在用FCM檢測外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood monouclear cell,PBMC)上mCD226的表達(dá)時,發(fā)現(xiàn)腫瘤患者PBMC上mCD226的表達(dá)(14例,1.1%-56.1%,中位數(shù)17.45%)明顯低于正常人(12例,43.1%-77.8%,中位數(shù)65.3%,P0.001)。在體外NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的模型中用重組表達(dá)的可溶型hCD226-Fc融合蛋白模擬天然sCD226的作用,發(fā)現(xiàn)hCD226-Fc能顯著抑制NK細(xì)胞對其靶細(xì)胞K562細(xì)胞的殺傷,濃度為1μg/ml時抑制率即可達(dá)到34%,而且這種抑制作用呈劑量依賴性。在佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)活化的正常人PBMC和Jurkat細(xì)胞上,3種蛋白酶抑制劑(金屬蛋白酶抑制劑1-10-phenanathroline、絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF和半胱氨酸蛋白酶抑制劑NEM)可以在上調(diào)mCD226的表達(dá)的同時下調(diào)培養(yǎng)上清中sCD226的水平,由于多種蛋白酶在許多腫瘤中含量可能有所增加,提示蛋白酶解作用可能是腫瘤患者血清中sCD226的形成機(jī)制。用免疫沉淀和Western blot的方法鑒定了血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清中sCD226的分子量,發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者和正常人血清以及PMA刺激的PBMC和Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)上清中,均存在~50 kDa的特異性條帶,這與CD226分子的胞膜外區(qū)分子量相符。另外,血清樣本中還存在一個~45 kDa的條帶,這一條帶在PMA刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清中不存在,提示不同蛋白酶對CD226的酶解作用可能發(fā)生在該分子胞膜外區(qū)的不同位置。 在搞清了腫瘤患者sCD226的表達(dá)、作用和來源的基礎(chǔ)上,我們提出了如下假說:腫瘤患者中升高的蛋白酶可能通過酶解作用導(dǎo)致了PBMC上mCD226表達(dá)下調(diào)而血清中sCD226的水平上調(diào),高水平的sCD226與其膜型配體CD112/CD155分子相結(jié)合,減弱了殺傷細(xì)胞上mCD226分子與腫瘤細(xì)胞表面膜型CD112/CD155的結(jié)合,從而抑制了殺傷細(xì)胞活化信號的產(chǎn)生,并最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。 本研究還用ELISA和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的方法觀察了抗人CD226的mAb LeoA1對混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte culture,MLC)和PBMC中細(xì)胞因子分泌格局及細(xì)胞亞群百分比的調(diào)控,發(fā)現(xiàn)被上調(diào)的有IL-10、GM-CSF和G-CSF等,被下調(diào)的有IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12 p40、IL-15、IL-23和TGF-α等,相關(guān)的細(xì)胞亞群包括Th1、Th2、CTL、NK以及單核/巨噬和DC。采用信號分子阻斷劑的手段,分析了CD226調(diào)控MLC細(xì)胞因子分泌格局的信號通路中可能涉及的信號分子主要有p38、JNK和PI3K。 最后,成功建立了小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型,證實(shí)了抗CD226抗體對EAE的發(fā)生有明顯的防治作用,其分子機(jī)制涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部炎細(xì)胞浸潤的減輕,脾臟CD25陽性的活化細(xì)胞數(shù)量的減少,以及脾臟IL-10+細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分率的增加。 簡言之,本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為闡明CD226分子在腫瘤和自身免疫性疾病中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為深入研究CD226參與機(jī)體多種生理功能和病理過程的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2506713