【摘要】： 樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子- 3 -結(jié)合非整合素( dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3 grabbing nonintergrin, DC-SIGN)是樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)表面的一種新型凝集素受體[1],在調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞黏附、遷移,激活初始T淋巴細(xì)胞,啟動(dòng)免疫應(yīng)答,以及病原體的免疫逃逸等多方面發(fā)揮重要作用[2-6],是結(jié)核病干預(yù)策略中的新靶標(biāo)。DC-SIGN是DCs表面結(jié)核桿菌的主要受體。結(jié)核桿菌可通過(guò)其胞壁成分--帶甘露糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan, ManLAM)與DC-SIGN分子結(jié)合,抑制DCs成熟[7-10]。DCs在抗結(jié)核免疫應(yīng)答中發(fā)揮著中心作用,它是唯一能激活初始T細(xì)胞,啟動(dòng)初始免疫應(yīng)答的抗原提呈細(xì)胞[6,8]。而DCs要發(fā)揮活化初始T細(xì)胞的作用,其前提是必須成熟。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種可高效、特異地下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)并在基因功能研究和基因治療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景的技術(shù)[11,12]。慢病毒表達(dá)載體是RNAi常用的載體之一,能將自身攜帶的片斷整合入宿主細(xì)胞基因組,在哺乳動(dòng)物各類細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),長(zhǎng)期抑制基因表達(dá)[13]。 本研究根據(jù)人DC-SIGN基因的mRNA序列選擇4條靶序列,設(shè)計(jì)合成雙鏈DNA,并經(jīng)PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序以及外源性篩選,確定RNAi有效靶序列,構(gòu)建并包裝產(chǎn)生人DC-SIGN基因RNAi慢病毒表達(dá)載體。利用構(gòu)建成功RNAi慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的DCs,通過(guò)流式細(xì)胞儀、RT-PCR以及Western blot檢測(cè)DCs表面DC-SIGN分子表達(dá)水平變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs表面成熟標(biāo)志物HLA-DR及CD86水平,ELISA檢測(cè)DCs培養(yǎng)上清液中IL-12、IL-10分泌水平,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力。通過(guò)以上研究以明確慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)DCs表面DC-SIGN分子表達(dá)水平的抑制程度以及對(duì)DCs成熟度和功能的影響。 研究結(jié)果:PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí),DC-SIGN核苷酸鏈序列插入正確,外源性篩選確定兩條有效靶序列。選擇其中一條有效靶序列包裝慢病毒,產(chǎn)生濃縮慢病毒懸液的滴度為1×10 9 T U/mL。利用人DC-SIGN基因RNAi慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DCs,流式細(xì)胞術(shù)、PCR及WB檢測(cè)均提示DCs表面DC-SIGN表達(dá)水平降低,流式細(xì)胞儀顯示各組間成熟標(biāo)志物HLA-DR及CD86差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ELISA結(jié)果顯示各組DCs培養(yǎng)上清液中IL-10、IL-12水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示各組DCs誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)論:本研究建立了一種穩(wěn)定、有效的轉(zhuǎn)染人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的DCs的方法,并能在體外細(xì)胞水平有效抑制DC-SIGN表達(dá),慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后的DCs能保持其原有的形態(tài)、生長(zhǎng)特性、成熟表型及免疫學(xué)功能。這為我們后續(xù)研究人DC-SIGN分子水平調(diào)控對(duì)下游抗結(jié)核免疫應(yīng)答功能的影響奠定了基礎(chǔ),對(duì)進(jìn)一步明確人DC-SIGN分子在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中的作用也有幫助,為結(jié)核病以及其它相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供了新的思路。
[Abstract]:The dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-binding non-integrin (DC-SIGN) is a novel lectin receptor[1] on the surface of a dendritic cell, The important role of initiating immune response and immune escape of pathogens[2-6] is a new target in the intervention strategy of tuberculosis. DC-SIGN is the main receptor of Mycobacterium tuberculosis on the surface of DCs. The tubercle bacillus can be combined with the DC-SIGN molecule through its cell wall component, such as the mannoose-capped liposia binomannan, and the ManLAM, to inhibit the maturation of the DCs[7-10]. The DCs play a central role in the anti-tuberculosis immune response, which is the only one that can activate the initial T-cells, The antigen presenting the initial immune response is cell[6,8]. DCs need to play the role of activating the initial T cells, provided that it is necessary to mature. RNA interference (RNAi) is an efficient and specific down-regulation of target gene expression and has a wide application prospect in the field of gene function research and gene therapy[11,12]. The lentiviral expression vector is one of the commonly used vectors of RNAi, which can integrate the self-carried fragments into the host cell genome, stably express small-molecule interference RNA (siRNA) in various mammalian cells, and inhibit gene expression for a long time[13]. In this study, four target sequences were selected according to the mRNA sequence of the human DC-SIGN gene, the double-stranded DNA was designed and amplified by PCR, the DNA sequencing and the exogenous screening, the effective target sequence of RNAi was determined, and the lentiviral expression of the human DC-SIGN gene was constructed and packaged. The expression of DCs on the surface of DCs was detected by flow cytometry, RT-PCR and Western blot. The expression of DCs-SIGN in the surface of DCs was detected by flow cytometry, RT-PCR and Western blot. The levels of IL-12 and IL-10 in the supernatant of the supernatant of DCs were detected by ELISA, and the proliferation of T-lymphocytes stimulated by DCs was detected by the mixed lymphocyte reaction. The ability of the above-mentioned studies to determine the degree of inhibition of the expression level of DC-SIGN molecules on the surface of DCs and to the maturity and function of DCs by clear lentiviral expression vector-mediated RNA interference The results of the study: The results of PCR and DNA sequencing confirmed that the sequence of the DC-SIGN nuclear acid chain was correctly inserted and the exogenous screening determined the two. Effective target sequence. Select one of the effective target sequences to package the lentivirus to produce a concentrated lentivirus suspension with a titer of 1 to 10 9 T U/ mL. The expression level of DC-SIGN in the surface of DCs was decreased by using human DC-SIGN gene RNAi lentiviral expression vector. The results showed that the expression of DC-SIGN in the surface of DCs was decreased by flow cytometry, and the difference of HLA-DR and CD86 among the groups was not statistically significant by flow cytometry. The results showed that there was no significant difference in the expression of HLA-DR and CD86 among the groups. There was no significant difference in the level of IL-10 and IL-12. The results of mixed lymphocyte reaction showed that there was no difference in the proliferation of CD4 + T lymphocytes induced by DCs in each group. The results of the study: This study established a stable and effective method for the transfection of DCs from the peripheral blood mononuclear cells of human peripheral blood, and can effectively inhibit the expression of DC-SIGN in the in vitro cell level, and the DCs transfected with the lentiviral expression vector can retain their original cells. the form, the growth characteristic, the maturity, Phenotypic and immunological function. This provides a basis for the effect of DC-SIGN molecular level regulation on the function of anti-tuberculosis immune response in the downstream. It is also helpful to further clarify the role of human DC-SIGN in the pathogenesis of tuberculosis and to prevent and treat tuberculosis and other related diseases.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2505526