【摘要】： 病理性心肌肥大既是高血壓、心臟瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心臟病等臨床常見疾病的一種并發(fā)癥,亦是影響心血管疾病發(fā)病率和死亡率的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。有研究發(fā)現(xiàn)在心肌肥大人群中心血管事件的發(fā)生率是無(wú)心肌肥大者的2~4倍。病理性心肌肥大的持續(xù)進(jìn)展將導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常和心力衰竭,嚴(yán)重影響心血管病患者的預(yù)后。基于此,對(duì)病理性心肌肥大發(fā)生機(jī)制的探討并尋找有效的干預(yù)措施,具有十分深遠(yuǎn)的臨床意義。近年來,對(duì)心肌肥大時(shí)心臟的功能學(xué)變化及細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)模式的改變已有比較深入的研究,但對(duì)心肌肥大發(fā)生的具體機(jī)制還不甚清楚。目前認(rèn)為心肌肥大是心臟對(duì)多種病理刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng),其形成與壓力負(fù)荷增加、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能異常密切相關(guān)。研究證實(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子,如血管緊張素、去甲腎上腺素、內(nèi)皮素及血小板源性生長(zhǎng)因子等,與相應(yīng)受體結(jié)合后能夠級(jí)聯(lián)激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,如JAK-STAT途徑、絲裂原活化蛋白激酶途徑及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶途徑等,隨后誘發(fā)核內(nèi)原癌基因的轉(zhuǎn)錄活化,顯著改變細(xì)胞行為特異性基因的表達(dá)水平,從而引起一系列生長(zhǎng)、增殖、分化等細(xì)胞效應(yīng)。在此過程中,亦有多種細(xì)胞因子如一氧化氮、緩激肽等參與對(duì)上述細(xì)胞效應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)過程,從而使細(xì)胞行為處于復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之中。形態(tài)學(xué)研究已經(jīng)指出,心肌肥大發(fā)生時(shí)心肌細(xì)胞發(fā)生了顯著的表型變化,同時(shí)伴有非心肌細(xì)胞的增殖。有鑒于此,開展關(guān)于信號(hào)分子及其后續(xù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究,對(duì)于深入認(rèn)識(shí)心肌肥大發(fā)生機(jī)制和探尋有效干預(yù)措施的意義不言而喻。近年來發(fā)現(xiàn)L-精氨酸可在體內(nèi)多種細(xì)胞所表達(dá)的一氧化氮合酶催化下,生成一氧化氮及L-瓜氨酸,該過程即L-精氨酸-一氧化氮途徑。心臟中的一氧化氮,除具有擴(kuò)張冠脈、增加冠脈血流量、降低心肌收縮力等效應(yīng)外,可能在抑制和逆轉(zhuǎn)心肌肥大形成的過程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)利用腹主動(dòng)脈縮窄大鼠模型及離體心肌細(xì)胞,從整體水平、細(xì)胞水平及分子水平分別探討心肌肥大發(fā)生時(shí)及其發(fā)生受到L-精氨酸-一氧化氮途徑影響后胞外刺激分子的合成變化、胞內(nèi)分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與核內(nèi)特異性基因表達(dá)模式的改變,從而闡釋病理性心肌肥大與多個(gè)信號(hào)分子之間的關(guān)系以及L-精氨酸-一氧化氮途徑對(duì)心肌肥大的作用和相關(guān)機(jī)制。 1大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型的制備及其效果的探討 探討、改進(jìn)大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型的制備術(shù)式并探究對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈的合適縮窄程度。 對(duì)兩組大鼠分別施行傳統(tǒng)術(shù)式與改良術(shù)式,然后用改良術(shù)式將另外四組大鼠的腹主動(dòng)脈內(nèi)徑分別縮窄至0.5mm、0.6mm、0.7mm和0.8mm,對(duì)比評(píng)價(jià)各組的存活率以及造模效果。 結(jié)果顯示:(1)改良術(shù)式組大鼠術(shù)后存活率90.00% (27/30)顯著高于傳統(tǒng)術(shù)式組66.67% (20/30);(2) 0.8mm組大鼠存活率86.67% (26/30)顯著高于0.7mm組63.33% (19/30), 0.6mm組43.33% (17/30)及0.5mm組3.33% (1/30);(3) 0.8mm組與0.7mm組兩組大鼠的平均動(dòng)脈壓、左心室重量指數(shù)、左心室室壁厚度以及心肌細(xì)胞直徑均無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果證實(shí),采用改良術(shù)式將腹主動(dòng)脈在結(jié)扎點(diǎn)處的內(nèi)徑縮窄至0.8mm,與將其內(nèi)徑縮窄至0.7mm、0.6mm或0.5mm相比,能在不影響造模效果的前提下,提高大鼠模型的存活率。 2 L-精氨酸-一氧化氮途徑負(fù)向調(diào)控血管緊張素II及其1型受體的表達(dá)水平 本實(shí)驗(yàn)利用腹主動(dòng)脈縮窄的大鼠模型及培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,從在體和離體水平分別研究心肌內(nèi)蛋白合成總量與心率、血壓、心肌內(nèi)一氧化氮(NO)和血管緊張素II(Angiotensin II,ATII)含量的關(guān)系,以及NO前體物質(zhì)L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)對(duì)上述指標(biāo)和心肌一氧化氮合成酶(NO Synthase, NOS)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin Converting Enzyme, ACE)與ATII受體表達(dá)的影響,進(jìn)而探討L-精氨酸對(duì)病理性心肌肥大的影響作用及相關(guān)機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分四組:(1)假手術(shù)組;(2)手術(shù)組:按前述方法造成大鼠腹主動(dòng)脈的機(jī)械性縮窄;(3)L-Arg組:腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后即灌飼L-Arg 600mg/kg?day-1;(4)L-硝基精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)組:腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后同時(shí)灌飼L-Arg 600mg/kg?day-1及L-NAME 50 mg/kg?day-1。術(shù)后6周,測(cè)量各組大鼠心率、血壓、左心室重/體重比值、左室心肌蛋白合成總量和NO、ATII的含量以及ACE mRNA的表達(dá)量。離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞亦分四組:(1)對(duì)照組:分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,無(wú)處理因素;(2)ATII組:分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞72小時(shí)后,培養(yǎng)液加入ATII(終濃度0.1μmol/L);(3)ATII+L-Arg組:分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞72小時(shí)后,培養(yǎng)液同時(shí)加入ATII(終濃度0.1μmol/L)和L-Arg(終濃度100μmol/L);(4)ATII+L-Arg+L-NAME組:分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞72小時(shí)后,培養(yǎng)液同時(shí)加入ATII(終濃度0.1μmol/L)、L-Arg(終濃度100μmol/L)和L-NAME(終濃度15μmol/L)。施加處理因素后48小時(shí),收集各組心肌細(xì)胞,檢測(cè)NO生成量、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible NO synthase, iNOS)mRNA和蛋白水平的表達(dá)量,以及ATII的1型受體(ATII receptor type 1, ATR1)、2型受體(ATII receptor type 2, ATR2)mRNA的表達(dá)量。 結(jié)果顯示:(1) L-Arg提高了腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心肌內(nèi)NO含量,降低了心肌ATII含量、心肌蛋白合成總量、左心室重/體重比值以及ACE mRNA的表達(dá)量;L-NAME可消除L-Arg的上述作用;(2)在離體條件下,與ATII組相比,ATII+L-Arg組心肌細(xì)胞NO含量、iNOS mRNA及蛋白水平的表達(dá)量均有提高, ATR1 mRNA表達(dá)水平下降;ATII+L-Arg+L-NAME組與ATII組就上述指標(biāo)相比無(wú)顯著性差異;各組細(xì)胞ATR2 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異;(3)多元逐步回歸分析顯示心肌內(nèi)蛋白合成總量與血壓水平、心率之間均不存在回歸關(guān)系,而心肌NO和ATII含量則可作為心肌內(nèi)蛋白合成總量的預(yù)測(cè)因子;(4)心肌內(nèi)ATII含量、ACE mRNA表達(dá)量及心肌細(xì)胞ATR1 mRNA表達(dá)量均與NO含量之間存在線形負(fù)相關(guān)關(guān)系。 以上結(jié)果證實(shí):(1)心肌肥大的形成與心肌內(nèi)NO、ATII含量密切相關(guān);(2) L-Arg通過增強(qiáng)心肌iNOS表達(dá),致NO生成增加。NO可減少心肌內(nèi)ATII生成,并通過調(diào)控心肌ACE及ATR1表達(dá)來抑制病理性心肌肥大的形成;(3) ATR2并未參與上述過程。 3 L-精氨酸-一氧化氮途徑抑制絲裂原活化蛋白激酶途徑的磷酸化激活在離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞發(fā)生肥大反應(yīng)時(shí),探討L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)對(duì)心肌細(xì)胞血管緊張素II受體(Angiotensin II Receptor, ATR)及絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)表達(dá)的影響,進(jìn)而闡明MAPK在心肌肥大發(fā)生中的作用以及L-Arg對(duì)心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的影響作用和相關(guān)機(jī)制。 用血管緊張素II (angiotensin II, ATII)、ATR抑制劑Saralasin、L-Arg和L-NAME (L-硝基精氨酸甲酯)分別作用于心肌細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組:(1)對(duì)照組:無(wú)處理因素;(2) ATII組:培養(yǎng)液中加入ATII (終濃度0.1μmol·L 1);(3) ATII + Saralasin組:培養(yǎng)液同時(shí)加入ATII (終濃度0.1μmol·L 1)和ATII受體抑制劑Saralasin (終濃度0.1μmol·L 1); (4) ATII + L-Arg組:培養(yǎng)液中同時(shí)加入ATII (終濃度0.1μmol·L 1)和L-Arg (終濃度100μmol·L 1);(5) ATII + L-Arg + L-NAME組:培養(yǎng)液中同時(shí)加入ATII (終濃度0.1μmol·L 1)、L-Arg (終濃度100μmol·L 1)和L-NAME (終濃度15μmol·L 1)。然后以[3H]-亮氨酸摻入法檢測(cè)細(xì)胞蛋白合成速率、比色法檢測(cè)一氧化氮(NO)生成量、RT-PCR及Western blotting檢測(cè)ATR及p38 MAPK的表達(dá)水平。 結(jié)果顯示:(1)給予L-Arg可緩解ATII引起的心肌細(xì)胞NO合成量下降,減弱血管緊張素II-1型受體(Angiotensin Receptor Type 1, ATR1)表達(dá)及下調(diào)p38 MAPK蛋白磷酸化水平,并降低心肌細(xì)胞蛋白合成速率;(2) ATR抑制劑Saralasin在降低ATR1表達(dá)水平的同時(shí)顯著下調(diào)p38 MAPK的蛋白磷酸化水平,總P38 MAPK表達(dá)水平未見明顯變化;(3)心肌ATR1表達(dá)水平及p38 MAPK蛋白磷酸化水平均與NO合成量之間存在線性負(fù)相關(guān)關(guān)系。多元逐步回歸分析顯示在ATR1與ATR2中,僅ATR1的表達(dá)水平與p38 MAPK蛋白磷酸化水平之間存在回歸關(guān)系。以上結(jié)果證實(shí):(1) p38 MAPK的磷酸化激活經(jīng)由ATR1介導(dǎo);(2) L-Arg可致心肌細(xì)胞NO合成量增加,后者可抑制ATR1介導(dǎo)的p38 MAPK蛋白磷酸化水平上調(diào),進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞肥大反應(yīng);(3) ATR2未參與p38 MAPK的磷酸化激活過程。 4 L-精氨酸-一氧化氮途徑抑制鈣離子介導(dǎo)的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶途徑的活化 利用急性分離的心肌細(xì)胞,探討L-精氨酸對(duì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin, CaN)表達(dá)的影響,進(jìn)而闡述CaN途徑在心肌肥大發(fā)生中的作用及其與L-精氨酸-一氧化氮途徑之間的關(guān)系。 腹主動(dòng)脈縮窄的術(shù)式及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組如前所述:(1)假手術(shù)組;(2)手術(shù)組:按前述方法造成大鼠腹主動(dòng)脈的機(jī)械性縮窄;(3)L-Arg組:腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后即灌飼L-Arg 600mg/kg?day-1;(4)L-NAME組:腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后同時(shí)灌飼L-Arg 600mg/kg?day-1及L-NAME 50 mg/kg?day-1。6周后,取各組大鼠心臟,利用Bradford法檢測(cè)左室心肌總蛋白含量,并以比色法檢測(cè)NO生成量。急性分離各組大鼠的心肌細(xì)胞,以熒光測(cè)定法檢測(cè)胞內(nèi)游離鈣離子濃度;并運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)CaN和胚胎期特異性基因心房利鈉因子(atrial natriuretic factor, ANF)的表達(dá)水平。以胚胎基因ANF表達(dá)水平顯著上調(diào)作為心肌肥大形成的標(biāo)志。 結(jié)果顯示:(1)在手術(shù)組大鼠的心肌細(xì)胞內(nèi),鈣離子濃度及CaN的表達(dá)水平顯著升高,胚胎基因ANF表達(dá)明顯增強(qiáng);(2)與手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞相比,在L-Arg組,心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及CaN的表達(dá)水平顯著降低, ANF表達(dá)水平亦明顯下調(diào);(3)在L-NAME組,觀察到L-NAME可取消L-Arg的上述效應(yīng);(4)相關(guān)分析顯示,心肌NO含量分別顯著負(fù)相關(guān)于心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、CaN及ANF表達(dá)水平;相反地,左室心肌總蛋白含量與心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度之間、與心肌細(xì)胞CaN表達(dá)水平之間分別具有顯著的線性正相關(guān)關(guān)系。 以上結(jié)果證實(shí):(1)心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度與CaN的表達(dá)水平是參與心肌肥大形成過程的重要因素;(2) L-精氨酸-一氧化氮途徑可顯著降低心肌細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度并下調(diào)CaN的表達(dá)水平,抑制CaN途徑的活化。 結(jié)論 1與傳統(tǒng)術(shù)式相比,改良術(shù)式能夠提高腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后動(dòng)物模型的存活率。 2采用改良術(shù)式將腹主動(dòng)脈在結(jié)扎點(diǎn)處的內(nèi)徑縮窄至0.8mm,與將其內(nèi)徑縮窄至0.7mm、0.6mm或0.5mm相比,能在不影響造模效果的前提下,提高大鼠模型的存活率。 3心肌肥大的形成與心肌內(nèi)NO、ATII含量密切相關(guān);L-精氨酸通過增強(qiáng)心肌iNOS表達(dá),致NO生成增加。NO可減少心肌內(nèi)ATII生成,并通過調(diào)控心肌ACE及ATR1表達(dá)來抑制病理性心肌肥大的形成。 4 ATR2未參與ATII和L-精氨酸分別介導(dǎo)的心肌肥大形成與消退過程。 5 ATR1介導(dǎo)p38 MAPK的磷酸化激活過程。 6 L-精氨酸-一氧化氮途徑可抑制ATR1介導(dǎo)的p38 MAPK蛋白磷酸化水平上調(diào),進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)。 7心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度與CaN的表達(dá)水平是參與心肌肥大形成過程的重要因素。 8 L-精氨酸-一氧化氮途徑可顯著降低心肌細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度并下調(diào)CaN的表達(dá)水平,抑制CaN途徑的活化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2505217